材料和试剂

Microtube
微量滴定板（Corning，Costar ^®，目录号：42592）
Miracloth（EMD Millipore，目录号码：475855）
氢氧化钾（KOH）（Sangon Biotech，目录号：A610441）
10倍磷酸缓冲盐水（PBS，1.35M NaCl，47mM KCl，100mM Na 2 HPO 4，20mM NaH 2 PO 3 > 4， pH = 7.4）（Beyotime，目录号：ST476）
链霉菌 plicatus几丁质酶（Sigma-Aldrich，目录号：C6137）
硼酸钠（Sangon Biotech，目录号：A100390）
GlcNAc（Sigma-Aldrich，目录号：PHR1432-1G）
氢钠（Na 2 HPO 4）（Sangon Biotech，目录号：A501727）
柠檬酸（Sangon Biotech，目录号：A501702）
二甲基氨基苯甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：D2004）
盐酸（HCl）
乙酸（Sangon Biotech，目录号：A501931）
生物素
吡哆素
硫胺素
核黄素
对氨基苯甲酸
烟酸
ZnSO 4·7H 2 O
3 <3> 3
MnCl 2·4H 2 O
FeSO 4·7H 2 O O
CoCl 2·6H 2 O ○
CuSO 4·5H 2 O
Na 2 MnO 4·2H 2 O O
Na 4 EDTA
NaNO 3
KCl
MgSO 4·7H 2 O→/ /
KH ₂ PO ₄
D-葡萄糖
蛋白胨
酵母提取物
Casamino酸
琼脂
McIlvaine的缓冲区（见配方）
Ehrlich的解决方案（见配方）
维生素溶液（见食谱）
微量元素（参见食谱）
20x硝酸盐（见食谱）
CM介质（见配方）

设备

软件

程序

所有菌株在固体CM培养基上于28℃培养7天。将琼脂培养物切成1×1mm的正方形，并将方块在液体CM中再培养2天
通过一层Miracloth过滤，从液体CM收集菌丝体。然后通过冷冻干燥器将菌丝体快速冻干24小时。使用涡旋混合器将5mg菌丝体与2ml微量管中的1ml 6％KOH混合，然后在80℃的水浴中温育90分钟。
将样品以16,000xg离心10分钟，弃去悬浮液。
每个沉淀物用1ml 1x PBS（其从10x PBS稀释）洗涤三次，然后以16,000xg离心5分钟以丢弃悬浮液。
每个沉淀物用0.5ml McIlvaine的缓冲液（参见Recipes）重新悬浮（Baker等人，2007）。每个样品中加入100μl几丁质酶。然后将样品在37℃下在黑暗中以220rpm在培养箱振荡器中孵育。
将几丁质酶处理的样品与等体积的0.27M硼酸钠（pH = 9.0）混合，并在PCR仪器中在100℃下孵育10分钟。
冷却至室温后，将200μl每个样品加入1ml Ehrlich's溶液（参见食谱），然后在37℃下在培养箱中培养30分钟。
将100μl的每个样品转移到微量滴定板的孔中，并用微量酶读数器在585nm下测量吸光度。标准曲线由0.1至2.0mM（0.1mM，0.5mM，1.0mM，1.5mM和2.0mM）GlcNAc的原液制备。

数据分析

标准曲线由0.1至2.0mM GlcNAc的原料制备。每个结果呈现至少三个重复测量。在SPSS 2.0（Chicago，IL，USA）中使用SDs和单因素方差分析（ANOVA）对治疗间差异的意义进行统计学评估。使用ANOVA对两个特定不同治疗的数据进行统计比较，随后如果ANOVA结果在P

0.05或 0.01。

笔记

食谱

McIlvaine的缓冲区
0.2M Na 2 HPO 4
0.1M柠檬酸（pH = 6.0）
Ehrlich的解决方案
10g 12.5％浓HCl（37％）和87.5ml冰醋酸的p-二甲基氨基苯甲醛
维生素溶液（100ml）
0.01克生物素
0.01g吡哆素
0.01克硫胺素
0.01 g核黄素
0.01g对氨基苯甲酸 0.01克烟酸
将ddH ₂ O加入到100ml中，并保存在4°C的深色玻璃瓶中
微量元素（100 ml）
2.2g ZnSO 4·7H 2 O
1.1g H 3 BO 3
0.5g MnCl 2·4H 2 O
0.5g FeSO 4·7H 2 O
0.17g CoCl 2·6H 2 O
0.16g CuSO 4·5H 2 O
0.15g Na 2 MnO 4·2H 2 O 5g Na 4 EDTA
将ddH 2亚O加入到100ml中，将pH调节至5.8，在4℃下储存
20x硝酸盐（1升）
120g NaNO 3
10.4克KCl
10.4g MgSO 4·7H 2 O→/ / 30.4g KH 2 PO 4
将ddH ₂ O添加到1 L，并保存在4°C
CM媒体
10g D-葡萄糖
2克蛋白胨
1克酵母提取物
1克酪蛋白氨基酸
1 ml维生素溶液
1毫升痕量元素
50ml 20x硝酸盐盐
将ddH ₂ O添加到1 L
对于固体培养基，加入15g琼脂并在121℃下高压灭菌20分钟

致谢

这项研究得到了中国自然科学基金重点项目（授权号31530063，ZZ），国家杰出青年科学基金（授权号ZZ）31325022，中国自然科学基金（批准号） 31271998，ZZ）和特别授权的教授（江苏，中国）。

参考文献

Baker，LG，Specht，CA，Donlin，MJ and Lodge，JK（2007）。＆nbsp; 壳多糖，几丁质的脱乙酰形式，对于新型隐球酵母中的细胞壁完整性是必需的。真核细胞 6（5）： 855-867。
Bulik，DA，Olczak，M.，Lucero，HA，Osmond，BC，Robbins，PW and Specht，CA（2003）。＆nbsp; 酿酒酵母中的甲壳素合成是为了补充具有葡糖胺和细胞壁应力的生长培养基。 Eukaryot Cell 2（5）：886-900。
Leloir，LF和Cardini，CE（1953）。生物合成葡萄糖胺。生物化学Biophys Acta 12（1-2）：15-22。
Song，W.，Dou，X.，Qi，Z.，Wang，Q.，Zhang，X.，Zhang，H.，Guo，M.，Dong，S.，Zhang，Z.，Wang， Zheng，X.（2010）。＆nbsp; R-SNARE同系物MoSec22是米曲霉米曲霉的分生型，细胞壁完整性和发病机制所必需的。 PLoS One 5（10）：e13193。