材料和试剂

玻璃管，12 x 75毫米（DUTSCHER SCIENTIFIC，目录号：110011）
管，厚壁，聚碳酸酯，1ml，11×34mm（Beckman Coulter，目录号：343778）
Stericup-GP无菌真空过滤器，聚醚砜0.22μm（EMD Millipore，目录号：SCGPU10RE）
迷你挤出机套件（迷你挤出机，2个Hamilton注射器，0.1μm聚碳酸酯膜，过滤器支架，保持器/加热块）（Avanti Polar Lipids，目录号：610000）
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（PC）（Avanti Polar Lipids，目录号：850457）
1-棕榈酰-3-油酰基-sn-甘油基-2-磷酸乙醇胺（PE）（Echelon，目录号：L-2368）
1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（羧基荧光素）（fluoPE）（Avanti Polar Lipids，目录号：810332）
磷脂酰肌醇3-磷酸diC16（PI3P）（Echelon，目录号：P3016）
来自猪脑的L-α-磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）（Avanti Polar Lipids，目录号：840045）
磷脂酰肌醇5-磷酸diC16（PI5P）（Echelon，目录号：P5016）
液氮
氯仿/甲醇（50/50，v/v）
PBS（w/o Ca/Mg）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
抗GST抗体（克隆B-14）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-138）
脂质储备溶液（见配方）
PBS中的60％和25％蔗糖溶液（参见食谱）

设备

氮气蒸发器（N-EVAP，Organomation，目录号：11250）
化学罩
标准加热水浴
Optima TLX超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima ^TM TLX）
TLA100.2转子（Beckman Coulter，型号：TLA100.2转子）
注意：该转子不再可以从Beckman Coulter获得。转子TLA120.2（Beckman Coulter，型号：TLA120.2）可以代替。
便携式紫外线灯
SDS-PAGE运行装置
蛋白质印迹装置
折射仪

软件

图像分析软件（例如，，ImageJ，NIH）

程序

准备大单层囊泡（LUVs）
1. 准备脂质储备溶液（参见食谱）。当使用荧光标记的脂质时，在整个过程中屏蔽直射光
2. 在玻璃管中制备1mM浓度的2x浓缩脂质混合物：PC：PE：fluoPE（70:28:2mol％）以评估基础结合性质和PC：PE：fluoPE：PIP（64:28:2:6 mol％）以评估蛋白质对每个PIP的特异性结合特性
3. 在氮气下蒸发
4. 用氯仿/甲醇（v/v）重悬二次，在氮气下蒸发，在玻璃管壁上形成不错的脂质饼。在这个阶段，不应该留下任何一块。
5. 在氮气下蒸发最后30分钟-1小时以消除任何痕量的溶剂
6. 重悬于37℃预热的PBS中，并在室温下放置1小时。
7. 在液氮/温水（40°C）中进行5次冻融循环。为获得最佳效果，请等待每个步骤的样品完全冷冻/解冻。进行这些冻融循环将有助于破坏脂质滤饼，并确保挤出机在以下步骤中的良好效率，从而改善结果。我们发现5个周期提供了最佳的结果可靠性，而不需要花费太多时间
8. 根据制造商的说明使用适当的膜尺寸（例如，用于LUV形成的0.1μm聚碳酸酯膜）安装小型挤出机。
9. 通过过滤器将脂质混合物挤出，通常为19次。收集并转移到新鲜的玻璃管中
LUVs蛋白质混合物
1. 在厚壁聚碳酸酯管中，将50μl的2xLUV与50μl的2xGST重组蛋白质混合，使终体积为100μl，最终浓度为0.5mM LUV和1mM重组蛋白。有关适应性，请参见注释部分。将纯化的GST蛋白作为阴性对照包含在LUV中
2. 在室温下孵育1小时。
3. 在PBS中加入100μl60％蔗糖，得到30％的最终蔗糖浓度。轻轻混合以获得均匀的溶液，但不破坏相互作用。参见图1的示意图。
4. 在顶部叠加250μl的25％蔗糖和50μl的PBS缓冲液，而不会扰乱层。
5. 在204℃离心，在20℃下（相当于TLA100.2转子上的70,000rpm）1小时。为了不扰乱层数并获得可靠的结果，使用比平常更慢的加速/减速参数（例如），Optima ^{TM上的加速度2 /减速度2 < sup> TLX超速离心机。
  
  图1.脂质体结合测定的示意图。在30％蔗糖中平衡的LUV和蛋白质混合物用25％和0％蔗糖分层，离心以允许LUV漂浮（70,000rpm [174,206 > xg ]在TLA100.2转子上）。从Hamilton的注射器从管的底部收集级分。}
收集分数

由于脂质体会由于fluo-PE而发荧光，使用汉密尔顿注射器在便携式UV灯下收集部分，从管的底部开始（参见图1的示意图）。

200μl底部分数

200μl中间分数

100μl含有LUVs和相关蛋白的顶级成分。

数据分析

将20μl顶部馏分与样品缓冲液混合，并通过SDS-PAGE分析。通过考马斯染色法或蛋白印迹法分析与GST部分或使用特异性抗体结合LUVs的重组蛋白质的量。可以使用图像分析软件（例如，ImageJ，NIH）通过光密度测定来测量带强度，以便比较不同PIP的结合特异性。通常，单独的GST标签不与LUV结合，但是必须将其作为阴性对照进行检查。如图2所示，我们以前使用这种技术来分析内质蛋白TOM1的不同结构域的PIP结合特异性（Boal等，2015）。与GAT域相比，我们证明了VHS域对PI5P的亲和力更高（图2B）。

图2.TOM1VHS但不是GAT结构域显示在脂质浮选测定中对PI5P结合的特异性。 A.TOM1结构域; B.将N末端GST标记的VHS或GAT结构域与含有6％mol所示PIP的脂质体孵育。在蔗糖垫上漂浮后，使用抗GST抗体（左图）通过蛋白质印迹分析结合的蛋白质。右侧面板显示了4个独立实验的量化。结果以平均值±SEM表示; -test * P 0.05; ns，不重要。

笔记

一旦准备好，LUVs储备溶液可以在4℃的氮气密封的玻璃管中保存几天，但是可能会预期一些氧化，并且在分析结果时应该小心。
根据蛋白质对LUV的亲和力，可以修饰重组蛋白的最终浓度。类似地，结合缓冲液的组成可以适应，例如缓冲液特异性，钙依赖性，封闭剂（无脂肪酸的BSA）。
离心步骤应以温和的加速/减速进行，以免干扰蔗糖层
使用fluoPE可以快速简便地显示浮选。收集分数时，必须注意不要打扰顶层，否则会引起交叉污染并降低结果的重复性。
重组蛋白的纯度至关重要。事实上，细菌污染物可能会大大改变结果。至少必须通过SDS-PAGE检测纯度，然后进行考马斯染色。必须通过全速离心来消除蛋白质聚集体。在使用GST标签进行亲和纯化的情况下，必须通过透析将洗脱缓冲液更换为结合缓冲液（例如PBS）。

食谱

脂质储备解决方案
在氯仿/甲醇中以1mg/ml的浓度在玻璃管中制备
储存于-20°C 注意：每次使用后，应用氮气流填充玻璃管，避免脂质氧化，但限制氯仿/甲醇的蒸发，因为这将改变库存的浓度。用Teflon橡胶拧紧盖子。
PBS中的60％和25％蔗糖溶液
将蔗糖溶于PBS（60％eq。771.9g/L和25％eq。275.9g/L）中。一旦完全溶解，用折射计检查密度并用PBS调整
注意：随着蔗糖浓度随温度而变化，请注意使缓冲液完全平衡。用Millipore stericup无菌真空过滤器过滤。为了防止细菌污染，蔗糖储备溶液必须保持无菌并且在4℃。

致谢

该协议从Bigay和Antonny（2005）的工作进行了修改。这项研究得到了国家发展和改革委员会的资助。国民经济基督教基金会法国肌营养不良协会（AFM）;以及国家中心科学院; RégionMidi-Pyrénées和欧洲基金（FEDER，FondsEuropéensdeDéveloppementRégional）。作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考文献

Bigay，J. and Antonny，B.（2005）。 COP涂层的组装 - 拆解周期的实时测定在规定尺寸的脂质体上。方法Enzymol 404：95-107。
Boal，F.，Mansour，R.，Gayral，M.，Saland，E.，Chicanne，G.，Xuereb，JM和Tronchère，H。（2015）。< a class ="ke-insertfile"href = "http://jcs.biologists.org/content/128/4/815.short"target ="_ blank"> TOM1是参与内体成熟调控的PI5P效应物。 128（4）：815-827。
Di Paolo，G。和De Camilli，P.（2006）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17035995"target =" _blank">磷酸肌醇在细胞调节和膜动力学中。自然 443（7112）：651-657。
Lemmon，MA（2003）。磷酸肌醇识别域。/a> 流量 4（4）：201-213。