材料和试剂

离心管，聚丙烯15 ml（Beckman Coulter，目录号：342082）
1.5ml微量离心管（Microtubes）（Corning，Axygen，目录号：MCT-150-C）
1.5ml聚苯乙烯分光光度计比色杯（KARTELL SPA CIA DELLE INDUSTRIE，目录号：1938）
超离心机薄壁聚集管13.2 ml（Beckman Coulter，目录号：331372）
0.45微米Millipore过滤器（MILLEX-HV PVDF）（EMD Millipore，目录号：SLHV033RS）
A-5型氧化铝（Sigma-Aldrich，目录号：A2039）
注意：本产品已停产。
微量吸头（200μl）（Daslab，目录号：162001X）
微量吸头（1000μl）（Daslab，目录号：162222X）
硅胶管（VWR，目录号：228-0713）
集胞藻 sp。 PCC 6803细胞（蓝藻的巴斯德培养物收集）
Milli-Q水
蒸馏水
硝酸钠（NaNO 3）（AppliChem，目录号：141702）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（AppliChem，目录号：141638）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4）（AppliChem，目录号：141512）
七水硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O）（Duchefa Biochemie，目录号：M0513）
柠檬酸一水合物（C 6 H 8 O 7 H 2 O）（EMD Millipore，目录号： 100244）
EDTA-Na 2（Duchefa Biochemie，目录号：E0511）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Merck，目录号：2382）
柠檬酸盐Fe-NH 4（Sigma-Aldrich，目录号：F5879）
磷酸钠（Na 2 CO 3）（Merck，目录号：6392）
硼酸（H 3 3 BO 3）（EMD Millipore，目录号：100165）
四氢化锰（II）四水合物（MnCl 2·4H 2 O）（EMD Millipore，目录号：1059270）
钼酸钠脱水（Na 2 MoO 4·2H 2 O）（Merck，目录号：6521）
硫酸锌七水合物（ZnSO 4·7H 2 O）（Merck，目录号：8883）
硝酸钴六水合物（Co（NO 3 3）2·6H 2 O）（AppliChem，目录号：131258）
硫酸铜（II）五水合物（CuSO 4·5H 2 O）（EMD Millipore，目录号：102790）
Tris Ultrapure（Duchefa Biochemie，目录号：T1501）
氯化铵（NH 4 Cl）（EMD Millipore，目录号：101145）
醋酸镁（Sigma-Aldrich，目录号：M5661）
β-巯基乙醇（EMD Millipore，目录号：805740）
甘油（AppliChem，目录号：131339）
液氮
三氯乙酸（TCA）（EMD Millipore，目录号：100807）（仅限西方）
丙酮（EMD Millipore，目录号：100014）（仅限西方）
氯化铵（EMD Millipore，目录号：101145）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S0389）
盐酸发烟47％（EMD Millipore，目录号：100317）
甲醇外推（Scharlau，目录号：ME0301005P）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A4503）
蛋白质测定染料试剂浓缩物（Bio-Rad Laboratories，目录号：5000006）
BG11生长培养基（参见食谱）
提取缓冲液（见配方）
蔗糖缓冲液1（参见食谱）
蔗糖缓冲液2（参见食谱）
60％（w/v）蔗糖（见食谱）
100％（w/v）TCA溶液（参见食谱）
80％（v/v）甘油（参见食谱）

设备

荧光灯
锥形瓶250毫升（杜兰集团，目录号：21 771 36）
用于制备溶液的烧瓶和磁力搅拌器
轨道摇床（IKA，型号：KS501）
Roux培养瓶1升（Sigma-Aldrich，目录号：CLS12901L）
玻璃瓶5升（Iso瓶蓝色瓶盖5000毫升）（Kavalierglass，Simax，目录号：CFB020）
天平（Sartorius，目录号：TE1502S和Precisa，型号：XT120A）
pH计（HACH LANGE SPAIN，CRISON，型号：BASIC 20）
流量计（ABB，型号：A6200）
压缩空气泵
离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-25）
刚性聚丙烯管（Fisher Scientific，目录号：11723904）
固定角转子（Beckman Coulter，型号：JLA-16.250，目录号：363934）
离心瓶聚丙烯250 ml（Beckman Coulter，目录号：356011）
瓷砂浆和杵（10厘米Ø）（费雪科学，目录号：S337621）
灭菌炉（JP SELECTA，目录号：2000381）
高压釜（三洋Labo高压灭菌器）（松下生物医学，型号：MLS-3020U）
自动微量移液管
涡流搅拌机（Heidolph Instruments，型号：Heidolph Reax 2000）
UV-VIS分光光度计（Thermo Electron，型号：BioMate 5）
固定角转子（Beckman Coulter，型号：JA-25.15）
梯度制造商（Hoefer，目录号：SG15）
蠕动泵（Pharmacia Biotech，型号：Pump P-1）
磁板搅拌器（Cole-Parmer，目录号：EW-04807-45）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：XL-80）
摇摆转子（Beckman Coulter，型号：SW 41 Ti）
使用TRIS ^{TM（Teledyne Isco）的ISCO UA-6检测器UV/VIS（密度梯度分馏器，Teledyne Isco，目录号：67-9000-176）}
微量离心机（Eppendorf，型号：5424/5415 R）
Thermoblock（Eppendorf Thermomixer compact）（仅限西方）
金属连接器（Parker-Legris，目录号：0180 04 00）
CO <2>气瓶容器

程序

整个协议的概述分为四个步骤，如图1所示

图1.协议中描述的完整过程的方案

培养集胞藻
1. 在补充有1g NaHCO 3 NaHCO 3的BG11培养基（Rippka等人，1979）中，在30℃下自发地生长集胞藻细胞，（BG11C）在连续照明下（50μmol光子m ^{sec ^-1，来自荧光灯的白光）。}
2. 生长阶段的估计
  使用体积为3-5L的细胞，根据每个实验的目的指数或静止生长期。通过测量细胞甲醇提取物中的总叶绿素含量来估计生长期（McKinney，1941）。
3. 收获细胞
集胞藻细胞的破裂和分级
1. 预处理
  将所有玻璃材料，瓷砂浆和杵在200℃的灭菌烘箱中加热3小时，所有塑料材料在121℃下高压灭菌20分钟。
  注意：无RNase的水用于制备所有缓冲液。
2. 细胞破裂细胞放在预先冷却的瓷砂浆中，同样重量的细胞和氧化铝。将冰沙放在冰桶的顶部。与杵混合，一旦细胞和氧化铝充分混合，继续研磨2分钟。在使用前立即加入约20ml的提取缓冲液（1或10 mM醋酸镁），加入β-巯基乙醇
3. 细胞分裂细胞的分化在两个15毫升的聚丙烯管中尽可能多地回收材料。在4℃下在JA-25.15转子中以10,000×g离心10分钟以除去氧化铝，细胞碎片和不间断的细胞。将上清液转移到新的15ml管中，并在4℃下在同一转子中以30,000×g离心30分钟。这种离心是完全消除膜所必需的。
4. 冻结储备
  在具有5％（v/v）甘油的1.5ml Eppendorf管中，从该离心步骤（S30级分）的上清液中分配等分试样。对于该过程，将1.5ml管置于冰上，并向每个管中加入40μl80％（v/v）甘油和600μlS30级分。使用微量移液器轻轻混合，并迅速冷冻管中液氮。在冷冻之前，保留一份等分试样以Bradford的标准方法测定该S30级分的总蛋白量，使用白蛋白牛作为参考（Bradford等人，1976）。通常在S30级分中获得总蛋白浓度为10-15μg/μl。
  注意：
  1. 当提取缓冲液和梯度溶液含有1mM Mg-醋酸盐（低Mg 2+）时，大多数细菌核糖体被分解成30S和50S亚基，但当使用10mM Mg-醋酸盐（高Mg 2+）时，在缓冲液和溶液中，70S空位核糖体峰主要观察。
  2. 值得注意的是，在蓝细菌中，藻胆蛋白占蛋白质总浓度的约30％。在考虑本程序的下一步所需的S30分数的数量时，必须考虑到这一点。
  3. S30分数可以在-80℃下以不同的等分试样储存，以在不同的日子加载分离的梯度。这是备份，以防在协议的后续步骤中存在任何问题，特别是在离心，分馏或生成梯度轮廓时。
蔗糖梯度的制备和超速离心
1. 蔗糖梯度的制备
2. 超速离心
  1. 使用微量移液管，并通过接近蔗糖梯度表面的单滴，轻轻地将S30级分（100-300μl）层压在10-30％蔗糖梯度的顶部。
  2. 在SW 41 Ti转子的预冷Beckman超速离心机中，在77,175 x g离心机在2℃下放置8小时。
核糖体颗粒的分离
1. 仔细地从离心机中取出梯度管，并在将其放入ISCO分馏系统之前用Milli-Q水完全填充每个管。
2. 使用60％（w/v）蔗糖从顶部分离梯度以将管的内容物推向UV检测器（A 254），使用TRIS ^{TM （流速1ml/min）。打开记录仪（1厘米/分钟，灵敏度1）以获得蔗糖梯度曲线，同时手动收集级分（0.5毫升）。}
3. 将收集的液体置于含有液氮的容器中，以迅速冷冻，然后在-80°C下储存，直至使用。
  预期配置文件的代表性示例如图2所示
  
  图2.显示游离亚基和70S空位核糖体的沉积曲线。将30个上清液在10-30％蔗糖密度梯度上在1mM（ A）或10mM（B）Mg 2+。小数字是指收集的分数。改编自（Galmozzi等人，2016年）。
4. 从这一点上对这些部分的处理取决于将给予它们的用途。在通过蛋白质印迹分析的情况下，用100％（w/v）TCA沉淀总蛋白（参见食谱）。

笔记

目前来自ISCO UA-6检测器的模拟信号可以使用National Instruments的Bus-Powered Multifunction DAQ USB Device（NI USB-6008）转换成数字信号。

食谱

BG11生长培养基（Rippka等人，1979）

BG11C（1L）
1.5g NaNO 3
1g NaHCO 3
0.2ml 1M K 2 HPO 4
10 ml浓缩液BG11（见下文）
高压灭菌在121°C，1 atm 20分钟
集中BG11
7.5g/L MgSO 4·7H 2 O→// 0.6 g/L柠檬酸
0.1g/L EDTA-Na 2
100 ml A5溶液（见下文）
3.6g/L CaCl 2·2H 2 O
0.6g/L柠檬酸盐Fe-NH 4
2g/L Na 2 CO 3
A5解决方案
2.86g/L H 3 3< 3< 3>
1.81g/L MnCl 2·4H 2 O -/- 0.31g/L Na 2 -MoO 4·2H 2 O
0.22g/L ZnSO 4·7H 2 O
0.05g/L Co（NO 3 3）·6H 2 O
0.08g/L CuSO 4·5H 2 O

提取缓冲区
20mM Tris-HCl，pH8.0
1或10 mM醋酸镁 20mM NH 4 Cl
5 mMβ-巯基乙醇（加入使用前）
将该溶液（缺少β-巯基乙醇）在121℃，1大气压下高压灭菌20分钟
蔗糖缓冲液1
20mM Tris-HCl，pH8.0
1或10mM醋酸镁 20mM NH 4 Cl
10％（w/v）sacarose
5 mMβ-巯基乙醇（加入使用前）
蔗糖缓冲液2
20mM Tris-HCl，pH8.0
1或10 mM醋酸镁 20mM NH 4 Cl
30％（w/v）sacarose
5 mMβ-巯基乙醇（加入使用前）
蔗糖缓冲液1和2由高压灭菌的无RNA酶的原料制备，蔗糖在末端溶解
60％（w/v）蔗糖
用Milli-Q水和加热液制备。蔗糖溶解后，用试管调节体积
100％（w/v）TCA溶液
向含有500g TCA的先前未开封的瓶中加入227ml无菌Milli-Q水。所得到的溶液将含有100％（w/v）TCA
80％（v/v）甘油
用Milli-Q水准备，并在121℃，1大气压下高压灭菌20分钟

注意：所有解决方案都保存在4°C。

致谢

该协议是由Sugita等人先前发表的研究进行了修改和修改的。（2000）。我们非常感谢J. de la Cruz博士的专家意见，有用的讨论和对稿件的批判性阅读。我们感谢M.Roldán的技术援助。这项工作得到了安达卢西亚军政府（授予P07-CVI-02792和BIO-284组）和西班牙经济部长（MINECO）和Fondo Social Europeo（FSE）（授权BFU2013-41712-P）的支持。

参考文献

Bradford，MM（1976）。一种快速敏感的方法用于利用蛋白质 - 染料结合原理定量微量的蛋白质。
Anal Biochem 72：248-254。
Galmozzi，CV，Florencio，FJ和Muro-Pastor，MI（2016）。蓝细菌核糖体相关蛋白LrtA参与集胞藻的后应激存活。 PCC 6803. PLoS One 11（7）：e0159346。
McKinney，G.（1941）。吸收光叶绿素溶液。生物化学 140：315-21。
Mutsuda，M。和Sugiura，M。（2006）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17046824"target ="_ blank" >蓝芽细胞rbcS mRNA的翻译启动需要38kDa的核糖体蛋白S1，而不是Shine-Dalgarno序列：在体外翻译系统中开发蓝细菌。/em> 281（50）：38314-38321。
Rippka，R.，Deruelles，J.，Waterbury，JB，Herdman，M.and Stanier，RY（1979）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://mic.microbiologyresearch.org/内容/journal/micro/10.1099/00221287-111-1-1"target ="_ blank">蓝细菌纯培养物的通用分配，菌株历史和性质。 Gen Microbiol 111 ：1-61。
Sato，N.，Wada，A.and Tanaka，A。（1998）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10050320"目标="_ blank">蓝色杆菌中的核糖体蛋白质欧洲斑马鱼M3株：存在L25蛋白。植物细胞生理39（12）：1367-1371 。
Sugita，C.，Sugiura，M.and Sugita，M。（2000）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10852488" target ="_ blank">蓝细菌聚球蓝细菌中的新型核酸结合蛋白。 PCC6301：与核糖体蛋白S1具有高度序列相似性的可溶性33-kDa多肽。 Mol Gen Genet 263（4）：655-663。