材料和试剂

0.45μm灭菌过滤器（Sartorius，目录号：16555-K）
0.22μm消毒过滤器（Sartorius，目录号：16532-K）
10 ml玻璃试管（Fisher Scientific，目录号：15175134）
玻璃显微镜载玻片（76 x 26 mm）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：10143562BEF）（见注1）}
玻璃显微镜盖玻片（22×22mm）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：3306）}
10ml注射器（BD，目录号：307736）
HDD（ATCC，目录号：15356）（Stolp和Starr，1963）
恶臭假单胞菌KT2440（ATCC，目录号：47054）（Nelson等，2002）
甘油（EMD Millipore，目录号：104094）
Bacto胰蛋白胨（BD，Bacto ^TM，目录号：211705）
酵母提取物（Conda，目录号：1702）
氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：106404）
用于分析的氢氧化钠（NaOH）颗粒（EMD Millipore，目录号：106498）
琼脂（BD，Bacto ^TM，目录号：214010）
营养肉汤（NB）（BD，Difco ^{TM，目录号：234000）}
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（EMD Millipore，目录号：102382）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（EMD Millipore，目录号：105833）
HEPES缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
溶菌酵母（LB）培养基（1L，pH7.5）（参见食谱）
LB，1.5％（w/v）琼脂（参见食谱）
NB培养基（1L）（参见食谱）
CaCl 2和MgCl 2盐（参见食谱）
稀释的营养肉汤（DNB）培养基（1L，pH7.4）（参见食谱）
DNB，0.7％（w/v）琼脂（参见食谱）
DNB，1.5％（w/v）琼脂（参见食谱）
HEPES缓冲区（见配方）

设备

离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
100ml烧瓶
30°C室（JP选择，目录号：001257）
30℃振荡培养箱（250rpm）（Eppendorf，New Brunswick ^{TM，型号：Innova} 44）
水浴（JP选择，目录号：6000138）
相位显微镜（Nikon Instruments，型号：OPTIFHOT-2）（注1）
分光光度计（Shimadzu，型号：UV-260）
徕卡DFC345 FX相机（Leica Microsystems，型号：DFC345 FX）
高压灭菌器

程序

掠夺猎物的Bdellovibrio 的文化（图1A和1B）
1. 捕食细胞悬液的制备（图1A）
2. （二步培养）的制备（图1B）
3. 分离Bdellovibrio 细胞（图1B）。捕食后，通过0.45μm过滤器过滤共同培养两次以恢复细菌。
  注意：对第二个过滤步骤使用新的过滤器。
4. 设置感兴趣的共培养物：将100-300μl的细胞扩散细胞转移到10ml OD 600的HEPES缓冲液中制备的10毫升猎物悬浮液（捕食者 - 猎物比例为1:10）。在30℃和250rpm下孵育24小时。
  
  图1.设置共同培养的Bdellovibrio 的工作流程。 A.捕食细胞悬浮液的制备（这里，恶臭假单胞菌KT2440）。 B.Bdellovibrio 细胞的制备。需要两步培养Bdellovibrio 以获得实验的捕食细胞。 C.双层方法来量化B细胞数。细菌 HD100。 D.发展B。在30℃下孵育2-3天后，在DNB琼脂平板上的猎物草坪上的细菌抗真菌HD100。细胞数可以定量为斑块形成单位（pfu/ml）。
计算Bdellovibrio和猎物细胞的活力（图1C）
在DNB培养基中连续稀释共培养物，从10 ^-1至10 ^-7（见注5）。
1. 使用双层方法（参见图1C）（Lambert等人，2003）确定生物活性Bdellovibrio
2. 计算猎物细胞活力
  在LB琼脂平板上放置10μl稀释液（见注5），并在30℃下孵育。猎物细胞计数为每毫升（cfu/ml）的集落形成单位。

数据分析

下面显示了Bdellovibrio 的掠夺活动的代表性图表（图2）。在实验开始时（0小时）和捕食24小时后的捕食者和猎物细胞数。恶臭 KT2440表示。

图2.用于研究B的掠夺能力的掠夺概况。细菌 HD100。恶臭 KT2440。 A.涉及B的共同文化的示意图。菌株HD100和对照培养物。没有食肉动物的恶臭。 B.在实验开始（0小时）和培养24小时后，猎物和捕食者细胞的活力。紫色条代表猎物细胞的活力，橙色条对应于捕食者活细胞数。误差条表示平均值的标准偏差（n≥3）。

笔记

如果可能，应使用相差显微镜检查捕食事件，以确保以下步骤的成功（见图3）。
根据用于生长Bdellovibrio 的猎物细胞选择培养基。
为了测量OD 600，制备目标培养物的1/10稀释度。例如，将100μl培养物加入到900μl盐水溶液中并混合。
为了在-80℃下储存Bdellovibrio，加入0.3ml 85％（w/v）甘油和0.7ml Bdellovibrio共培养物和猎物细菌至一个低温小瓶，并将管直接放在-80°C冰箱中。可以通过简单地用无菌回路刮伤低温小瓶的冰并将其添加到猎物悬浮液中来恢复细胞。不需要冷冻用于接种的低温小瓶。
如果预期高浓度的细胞，则进一步稀释样品。例如，通过向Eppendorf管中加入100μl的共培养物至900μl的DNB培养基中制备1:10的连续稀释液并重复直至获得所需的浓度。
DNB 0.7％（w/v）琼脂管可以预先制备并在室温下储存。使用前，将管子在150-200℃的水浴中熔化，并保持在45-50°C
分别制备DNB培养基（或HEPES缓冲液）和CaCl 2和MgCl 2盐。使用前立即加入盐。

图3.共同文化B。杀菌剂恶臭，KT2440在显微镜下。 A.捕食开始时的共培养（时间零）; B.孵育24小时后，只能观察到捕食性细胞。使用100x相位对比度物镜和用徕卡DFC345 FX相机拍摄的图像，可以常规地显示文化。

食谱

溶菌酵母（LB）培养基（1L）
10克Bacto胰蛋白胨
5克酵母提取物
10克NaCl
使用1N NaOH调节至pH 7.5 在121℃高压灭菌20分钟
LB，1.5％（w/v）琼脂（1L）
10克Bacto胰蛋白胨
5克酵母提取物
10克NaCl
使用1N NaOH调节至pH 7.5 15克琼脂
在121℃高压灭菌21分钟
NB中（1L）
8 g NB
在121°C高压灭菌20分钟
CaCl 2和MgCl 2盐
2mM CaCl 2·2H 2 O O
3mM MgCl 2·3H 2 O
通过0.22μm过滤器过滤灭菌至无菌容器中
稀释营养液（DNB）培养基（1L）（见附注7）
0.8 g NB
使用1N NaOH调节至pH 7.4 高压灭菌器
加入CaCl 2和MgCl 2盐（参见配方4）
DNB，0.7％（w/v）琼脂（1L）（见注7）
0.8 g NB
使用1N NaOH调节至pH 7.4 7克琼脂
在121℃高压灭菌20分钟
加入CaCl 2和MgCl 2盐（参见配方4）
DNB，1.5％（w/v）琼脂（1L）（见附注7）
0.8 g NB
使用1N NaOH调节至pH 7.4 15克琼脂
在121℃高压灭菌20分钟
加入CaCl 2和MgCl 2盐（参见配方4）
HEPES缓冲区（见注7）
25 mM HEPES缓冲液
使用NaOH颗粒调节至pH 7.8 在121℃高压灭菌20分钟
加入CaCl 2和MgCl 2盐（参见配方4）

致谢

该方案被修改并根据先前描述的掠夺性测定（Martínez等人，2016; Lambert等人，2003）进行了修改。这项工作由欧盟第七框架计划资助，授权协议第311815号（SYNPOL），以及马德里组合（P2013/MIT2807）和西班牙经济贸易大臣（BIO2010-21049，BIO2013-44878）的赠款-R）。

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