材料和试剂

50 ml螺旋盖聚丙烯（PP）管，无菌，无热原（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
15 ml螺旋PP管，无菌（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
取决于所使用的质粒的大肠杆菌菌株（参见注释）
甲醇HPLC级（EMD Millipore，目录号：106018）
丙酮类年级以上（EMD Millipore，目录号：100014）
二氯甲烷年级以上（Fisher Scientific，目录号：10626642）
ddH ₂ O
醋酸铵等级（EMD Millipore，目录号：101116）
乙腈HPLC级（EMD Millipore，目录号：113358）
乙酸乙酯HPLC级（Merck Millipore，目录号：113353）
溶菌酵母培养基（Carl Roth，目录号：X968.3）
洗脱液（参见食谱）

洗脱液A
洗脱液B
洗脱液C

设备

颜料提取：

光度计（Eppendorf，型号：BioPhotometer 6131）
Vortexer（科学工业，型号：G-560E）
超声波浴（Elma Schmidbauer，型号：Transsonic T 460，或BANDELIN electronic，型号：Sonorex TK52）（见注释）
离心机（Beckman Coulter，型号：Avanti J-25）
用于50ml管的离心转子（Beckman Coulter，型号：JA25.50），用于15ml管的圆底适配器（Corning，型号：8441）

HPLC分析：

具有四元泵，在线脱气机，恒温自动进样器，柱加热器和光电二极管阵列（PDA）检测器（Waters，型号：2795分离模块和2996光电二极管阵列检测器）的HPLC系统
C30柱250×4.6mm（5.0μm，250×4.6mm）（Bischoff，型号：ProntoSIL 200-5-C30，目录号：2546H300PS050）
保护柱20×4.0mm（5.0μm，20×4.0mm）（Bischoff，型号：ProntoSIL 200-5-C30，目录号：6302H300PS050），连接到保护筒保持器的列（Bischoff，目录号：1502 0508）

软件

HPLC软件（Waters：Empower Pro）

程序

细菌培养
1. 对于细菌的生长，使用无菌的50ml PP管（松散拧合的帽）与15ml LB-培养基，获得最佳体积/表面比和氧气供应。接受新鲜变换的E。大肠杆菌。
2. 让细菌培养物在28℃和250rpm下生长至0.5-1.0之间的OD 600。这通常需要10至16小时，但可能会因使用的致癌质粒而异。如果培养物变得太致密，则可将其稀释至0.100的OD 600，并进一步培养直至达到推荐的OD。避免在E中积聚的类胡萝卜素的光异构化。大肠杆菌，培养生长和色素提取应在昏暗的灯光或红光下进行
细胞收获和色素提取
1. 将10ml培养液转移到15ml PP管中，通过离心（4,000 x g，4℃，4分钟）收获细菌，并倾倒掉弃去上清液。
2. 再次旋转含细菌的PP管（11,000 x g，4℃，1分钟），并通过吸移除去剩余的上清液。确保没有残留的LB培养基（图1A给出了所得细菌颗粒的实例）。
3. 将样品放在冰上以避免类胡萝卜素的热异构化。
4. 在颗粒上加入200μl预先烧制的甲醇，并通过在超声波浴中重复涡旋（10秒）和超声波处理（10秒）完全悬浮细胞，并在冰上间歇冷却。为了避免样品升温，连续的涡旋和超声处理循环在将管放回冰之前不应超过10秒。
5. 加入200μl预先烧制的丙酮，并按照步骤B4所述的涡旋和超声处理进行混合
6. 加入200μl预先冷却的二氯甲烷，再按照步骤B4所述的振荡和超声处理混合
7. 将管在冰上孵育2分钟。如果（浑浊）样品呈现均匀性，则进行步骤B8;如果存在相分离，则加入50μl甲醇，通过涡旋混合并重复步骤B7（参见图1为均相[例B]和不需要的相分离的实例[图C]，这是由于步骤中不完全去除LB培养基B2）
8. 旋转管（11,000×g，4℃，4分钟），并将400μl含有溶解的颜料的着色上清液转移到HPLC小瓶中（图1D显示离心后的样品）。确保不要打扰沉淀。
  
  图1.提取程序的不同阶段的图示。A.步骤B2后的细菌沉淀（通过离心收集细胞）; B.产生步骤B7的浊度样品（通过超声处理和涡旋萃取颜料）; C.如果在步骤B4中没有完全去除LB培养基，则可能在步骤B7中发生的不希望的相分离; D.步骤B8后的有色上清液和无色颗粒（离心清除提取物）

分离和分析类胡萝卜素

对于HPLC分析，使用以下参数：柱温28℃;样品温度10℃;注射体积200μl;流量1.3 ml/min，标准检测波长440 nm

在第一次测量之前，应在28℃下用10％洗脱剂A和90％洗脱液B（1.3ml/min）将柱平衡10分钟。

通过应用根据表1的线性变化的三元梯度来分离类胡萝卜素

在连续运行之间，用10％洗脱剂A和90％洗脱液B（1.3ml/min）使柱平衡7分钟。为了避免样品携带，建议在HPLC运行之间用100％甲醇清洗注射针头（这是大多数自动进样器的默认程序;如果使用汉密尔顿注射器手动注射，每次样品注射后直接冲洗注射器至少三次）。

用于鉴定可以在使用E的颜色互补测定中合成的最常见的类胡萝卜素。将所检测的颜料的保留时间和吸光度光谱与本文提供的实施例（图2和3在"代表性数据"部分）或使用Britton等人进行比较。（2004）作为参考
表1.用于提取的类胡萝卜素的HPLC分析的三元梯度。洗涤剂组合物在"配方"一节中给出。流量为1.3ml/min，洗脱液变化为线性。

时间[min]	洗脱液A [％]	洗脱液B [％]	洗脱液C [％]
0	10	90	---
0.75	---	100	---
2.5	---	60	45
8	---	50	50
23	---	10	90
26	---	10	90
26.5	---	---	100
30	---	---	100
32	---	100	---
33	10	90	---

代表数据

图2.代表性的色谱提取物的色谱提取物。大肠杆菌 将TOP10细胞用来自细菌和藻类的不同组合的类胡萝卜素生物合成基因的质粒转化，在液体培养物中生长至0.5-1.0的OD 600，收获，如方案中所述提取，并使用表1中规定的HPLC梯度在C30柱上分析颜料提取物。颜料的平均保留时间在括号中给出。色谱图归一化为具有最高吸光度的峰。请注意，颜色的相对保留（甚至其洗脱顺序）可能会在C30和C18色谱柱之间有很大差异！

图3.使用E进行的颜色互补分析中可能合成的一些最常见的类胡萝卜素的在线PDA光谱。大肠杆菌 。使用C30色谱柱的色素和表1中规定的HPLC梯度的平均保留时间在括号中给出。吸光度谱被归一化为最大吸光度。

笔记

选择合适的电子邮件大肠杆菌菌株取决于所使用的类胡萝卜素质粒和待累积的类胡萝卜素的类型。许多生物质素基于pACYC184（New England Biolabs）作为骨架（Misawa等人，1995; Cunningham和Gantt，2007）。使用这些质粒，一些作者观察到TOP10或TOP10F细胞中类胡萝卜素的产量最高（Wurtzel等人，1997; Cunningham和Gantt，2007），而另一些作者报告了矛盾的结果，建议使用SURE细胞（Chae等人，2010）。我们更喜欢TOP10，因为这种菌株（与大多数其他流行的大肠杆菌菌株相反）不是琥珀抑制因子，因此防止用UAG（琥珀）终止密码子的基因的翻译不正确地终止。深入讨论了用于色彩互补分析的菌株和质粒的最佳组合。大肠杆菌超出本协议的范围。关于使用类胡萝卜素积累菌株的颜色互补测定的概述。大肠杆菌，读者可以参考Cunningham和Gantt（2007）。
当暴露于明亮的光线和升高的温度时，类胡萝卜素很可能形成异构体。为了避免异构化的假象，提取过程中样品应避免受光和热的影响
对于超声处理，推荐使用标准超声波浴（3L的固定超声波频率为35kHz，功率为120〜240W）。
在步骤B7中，如果提取溶剂太极性，则仅在加入二氯甲烷后进行相分离。在大多数情况下，这是由于在步骤B2中残留的LB培养基不完全去除引起的。小心去除所有剩余的LB培养基，而不会干扰沉淀物。
如果在预计收获时间的细菌培养物的OD值仍然很低（OD为0.1-0.3），则步骤B4-B6中使用的溶剂量可以按比例缩小到100μl。在步骤B8中，仅将150μl转移到HPLC小瓶中，并注射100μl。
当在黑暗中10℃保存在自动进样器中时，颜料应保持稳定，并在溶液中保持至少6小时（我们验证了这一点对于番茄红素，α-胡萝卜素和β-胡萝卜素）。
用于C30色谱柱的大多数HPLC方法都使用甲基叔丁基醚（MTBE）代替乙酸乙酯作为最强洗脱液的二元或三元梯度。这里引入的三元梯度是基于通常用于C18色谱柱的洗脱液（参见例如，，Kraay等人，1992），并且能够在不更换的情况下在C30和C18色谱柱之间进行切换的任何洗脱液。当使用不同的HPLC梯度时，验证本方案中使用的萃取混合物与注射样品时应用的洗脱组分的相容性至关重要。
如果定量分析颜料变化，检测波长的PDA信号不得超过检测器的线性范围。否则重复使用相应样品的注射体积或适当稀释度的HPLC分析

食谱

洗脱液

洗脱液A：85％（v/v）甲醇，15％ddH 2 O，0.075M乙酸铵，
洗脱液B：90％（v/v）乙腈，10％ddH 2 O -/-
洗脱液C：100％乙酸乙酯

致谢

该协议的简短版本已在Blatt等人发布。（2015）。我们感谢卡尔蔡司基金会的财务支持。

参考文献

Blatt，A.，Bauch。 ME，Pörschke，Y.和Lohr，M。（2015）。 82（4）：582-595。
Britton，G.，Liaaen-Jensen，S.，Pfander，H.，Mercadante，AZ and Egeland，ES（2004）。< a class =" ke-insertfile"href="http：//trove.nla。 gov.au/work/9907327?selectedversion=NBD40842148">类胡萝卜素手册
Chae，HS，Kim，KH，Kim，SC和Lee，PC（2010）。代谢工程化的大肠杆菌中的菌根依赖性类胡萝卜素生产。 Appl Biochem Biotechnol 162（8）：2333-2344。 />
Cunningham，FX，Jr. and Gantt，E.（2007）。用于鉴定和分析类胡萝卜素途径酶的质粒组合：以Adonis aestivalis作为案例研究。 Photosynth Res 92（2）：245- 259.
Kraay，GW，Zapata，M。和Veldhuis，MJW（1992）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.0022-3646.1992。 00708.x/abstract"target ="_ blank">分离叶绿素， c _{通过反相C18高性能海洋浮游植物的 2}和 c ₃液相色谱。 J Phycol 28（5）：708-712。
Misawa，N.，Satomi，Y.，Kondo，K.，Yokoyama，A.，Kajiwara，S.，Saito，T.，Ohtani，T.and Miki，W。（1995）。< a class = ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7592436"target ="_ blank">海洋细菌类胡萝卜素生物合成基因簇和虾青素生物合成途径的结构和功能分析基因水平。细菌学177（22）：6575-6584。
Wurtzel，ET，Valdez，G.和Matthews，PD（1997）。变质E中类胡萝卜素基因表达的变化。大肠杆菌菌株。 Biores J 1：1-11。