材料和试剂

1.5 ml管子
10厘米盘
12孔板（Corning，Falcon ^®，目录号：353043）
白色96孔分析板（Corning，目录号：3912）
冰
HEK293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）在低通道
DH5α感受态细胞
引物（用于定点诱变的寡核苷酸引物的序列）：
正向5'-CGACTTCACGGTGAATTTGGACAATCCGCAGGGGATGGAAGG-3'
反向5'-CCTTCCATCCCCTGCGGATTGTCCAAATTCACCGTGAAGTCG-3'
感兴趣的启动子，如这里，插入pLightSwitch_prom质粒载体（SwitchGear Genomics，目录号：S706788）中的 ITGA1 近端启动子序列
携带要表征的活化剂或阻遏物的质粒构建体，例如如下所述：pcDNA-空载体，pcDNA-MYC和pCMV-MAD，如Ni等人所述，2005
pGL4.13质粒（luc2/SV40）作为转染效率的对照
GeneArt定点诱变试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：A13282）}
DNase和RNase游离水
蒸馏水
0.5 M EDTA，pH 8
SOC媒体
LB琼脂板
台盼蓝色
有效转染试剂（QIAGEN，目录号：301425）
PBS
DMEM培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11995073）}
胎牛血清（FBS）（BOLLE COMMUNICATION，WISENT，目录号：080-150）
GlutaMAX（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：35050061）
HEPES（BOLLE COMMUNICATION，WISENT，目录号：330-050-EL）
双荧光素酶报告分析系统（Promega，目录号：E1980）
荧光素酶分析底物
萤光素酶测定缓冲液
用于HEK293T细胞的DMEM培养基（参见食谱）
LAR II解决方案（参见食谱）
1x停止& Glo（见配方）

设备

猎户座微孔板发光计（Berthold，Bad Wildbad，Germany）
MyCycler个人热循环仪用于PCR反应（Bio-Rad Laboratories）
水浴
细胞培养箱

软件

MatInspector基于Web的软件。 Genomatix（慕尼黑，德国）
https://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html
Blast Global对齐
https： //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&PROG_DEF=blastn&BLAST_PROG_DEF=blastn&BLAST_SPEC=GlobalAln&LINK_LOC=BlastHomeLink

程序

启动子分析

目的启动子的近端启动子序列，即ITGA1基因，可以从参考人类基因组或从switchdb网站下载： http://switchdb.switchgeargenomics.com/productinfo/id_706788/
Genomatix网站：上传启动子序列并使用默认参数或使用启动子搜索。
指引详见：
https://www.genomatix.de/online_help/help_matinspector/matinspector_help.html＃eldo_promoters
将鉴定的响应元件与共有序列（其结合转录因子）进行比较。例如，对于MYC，将可能的响应元素与E盒元素CACGTG进行比较。除了用软件获得的结果之外，强烈推荐对启动子序列的视觉分析。

定点诱变
手工设计引物并改变核苷酸，以便完全修饰识别的响应元件的序列（避免为另一个转录因子产生响应元件）。突变应位于正向和反向引物的中心位置。引物应互补，长度为35至45个核苷酸以确保适当的退火。

准备PCR混合物（引物除外，所有试剂均包含在GeneArt Site-Directed Mutagenesis Kit中）
PCR反应
重组反应
该步骤允许质粒从线性转换为圆形形式。
在1.5ml管中加入4μl反应缓冲液（5x），2μl酶混合物（10x），4μlPCR样品，并用无RNase的水完成20μl。在室温（RT）下孵育10分钟。停止与1微升0.5 M EDTA反应。复合后应立即开始下一步。在开始重组反应之前准备转化步骤。
转型

在冰上解冻小瓶DH5α细胞5至7分钟。
将2μl重组反应直接转移到DH5α细胞小瓶中，轻轻敲打混合（反应A）。
在冰上孵育管12分钟。
立即将小瓶在42℃孵育30秒（不超过30秒），然后在冰上再孵育2分钟。
向每个小瓶中加入250μlSOC培养基（反应A），然后在225rpm摇动下在37℃下孵育1小时（反应B）。
从反应B中加入10μl到90μlSOC培养基，然后将100μl扩增到LB平板上并孵育过夜
选择5至10个菌落，并从细菌中分离出DNA
通过DNA测序分析和确认启动子中诱导突变的存在。
将DNA存储在-20°C。

瞬时转染

培养补充有10％FBS（不含抗生素）的DMEM培养基中的HEK293T细胞
使用胰蛋白酶解离HEK293T细胞（每10cm皿1ml），并在37℃下孵育2分钟。加入DMEM并计数活细胞（使用台盼蓝）悬浮液，然后在12孔板中每孔铺板50,000个细胞。向每个孔中加入1ml DMEM 10％FBS培养基。
第二天开始瞬时转染。
对于转染，在1.5ml试管中制备质粒，如下例所示：

表1.用于瞬时转染HEK293T细胞的质粒制备

表2.用于比较野生型和突变的ITGA1启动子的质粒混合物

质粒数量为ng
X：无质粒转染
转染每个孔相同总量的质粒。
金额为一口井，计算一式三份。
加入50μl缓冲液EC和1.5μl增强剂，轻轻混匀，孵育5 min
加入Effectene试剂（2μl/孔），轻轻混合，然后孵育10 min
更换12孔板中的培养基，然后将质粒混合物加入每个孔中。孵育48小时。
将一体积的被动裂解缓冲液加入到四体积的蒸馏水中。
从孔中取出培养基，并用冷的1x PBS轻轻冲洗一次
向12孔板的每个孔中加入250μl1x被动裂解缓冲液，然后轻轻摇动15分钟。
发光计设置：设置注射器1和2以分配50μl的LARII和Stop& Glo解决方案
对于测量，使用10秒的读取时间和2秒作为延迟。
从每个PLB裂解液中转移10μl，放入96孔板（避免移液细胞碎片）
运行荧光素酶活性的测量。

数据分析

应使用MatInspector ^©软件识别的响应元素应根据其与共有序列的相似性进行分析和选择。作为不完全序列的共有响应元件（对于转录因子研究）具有相同序列的响应元件应考虑到诱变分析（Boudjadi et al。，2016; Chen et al。 al。，2011; Teye等人，2008）。
质粒突变后，新质粒的序列应与原始序列比对，以确认引入的突变是野生型启动子序列和突变序列之间的唯一差异（图1）。

图1.启动子序列的比对。将突变的ITGA1启动子序列与野生型启动子的比较。当存在时，垂直条表示两个序列之间相同的核苷酸。正向引物的序列以蓝色加下划线。红色方块指出突变的响应元素（MYC的第一个响应元素的突变），如Boudjadi等人，2016所报道的。
瞬时转染和细胞裂解后，荧光素酶的酶活性（反映启动子活性）将用发光计量化。所获得的数据将用于分析每种条件下的启动子活性。获得两个值：第一个表示感兴趣的启动子的活性，第二个表示对照启动子的活性（反映转染效率）。对于每个井，最终值是第一个和第二个值之间的比率。
数据可能会显示为折叠变化，如图2所示。

图2。分析ITGA1启动子活性。与空载体（EV）相比，启动子基因报告物测定的结果显示相对荧光素酶活性为倍数变化。将野生型ITGA1启动子载体与空载体，MYC表达载体（MYC），显性阴性MAD（MAD）或两者（MYC-MAD）一起转染到HEK293T细胞中。在用空载体或MYC表达载体转染后，深灰色柱表示突变的ITGA1启动子（MYC的第一反应元件的突变）的活性。重复实验三次，一式三份进行。 t检验。 ** 0.01，*** 0.001。 Ns：不重要。

笔记

进行模板质粒的甲基化以便在转化后允许其通过内源核酸酶在宿主细胞中消化。因此，模板将被消除，只有突变的质粒将存在于转化的细胞中
HEK293T细胞在转染期间不能达到融合水平
HEK293T细胞形成脆弱的单层，因此介质的变化应以温和的方式进行
MAD/MAX异二极体识别与MYC/MAX相同的响应元件。单独或与MYC一起转染MAD的事实降低了ITGA1启动子的活性，这表明当单独引入MYC时，该活性增强。
将DMEM储存在4°C;使用前请加热至37°C，避免长时间保暖。
不要通过上下移动来混合细菌小瓶。
孵化期间倒置LB板，以避免冷凝和污染。
准备100ng /μl的质粒以促进转染过程

食谱

用于HEK293T细胞的DMEM培养基
DMEM
10％FBS
2 mM GlutaMAX
10 mM HEPES
LAR II解决方案
在荧光素酶测定缓冲液II（105ml）中重悬冻干燥的荧光素酶测定底物
等分并储存于-20°C
1x停止& Glo
稀释适量的Stop& Glo底物（库存50x）在Stop& Glo试剂（始终准备新的溶液）

致谢

我们感谢伊丽莎白鲱鱼审查手稿。这项工作得到了加拿大卫生研究所资助项目MOP-123415的支持（JFB是由魁北克圣地亚哥教会资助的Sherbrooke大学中心医院中心的成员，该协议改编自Boudjadi < （2016），最初出版于癌基因。

参考文献

Boudjadi，S.，Carrier，JC，Groulx，JF和Beaulieu，JF（2016）。整联蛋白α1β1表达由结肠直肠癌细胞中的c-MYC控制。癌基因<35>（13）：1671-1678。
Chen，Y.，Xu，J.，Borowicz，S.，Collins，C.，Huo，D. and Olopade，OI（2011）。 c-Myc通过乳腺癌细胞中的远端启动子元件激活BRCA1 基因表达。 BMC癌症 11：246。
Ni，H.，Dydensborg，AB，Herring，FE，Basora，N.，Gagne，D.，Vachon，PH和Beaulieu，JF（2005）。< a class ="ke-insertfile"href ="http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16007143"target ="_ blank">结直肠癌中β4整联蛋白亚基的功能形式的上调与c-Myc表达相关。癌基因 24（45）：6820-6829。
Teye，K.，Okamoto，K.，Tanaka，Y.，Umata，T.，Ohnuma，M.，Moroi，M.，Kimura，H。和Tsuneoka，M。（2008）。表达的TAF4b 基因是由MYC通过非 - 而不是规范的E-box，它有助于其对MYC的具体回应。 Int J Oncol 33（6）：1271-1280。