材料和试剂

6孔板（Fisher Scientific，目录号：08-772-33）
无菌移液器
5毫升（康宁，目录号：4051）
10毫升（康宁，目录号：4101）
25毫升（康宁，目录号：4251）
70μm细胞过滤器（Corning，目录号：431751）
5毫升注射器，无针（BD，目录号：309646）
无菌锥管
15毫升（康宁，目录号：352099）
50毫升（康宁，目录号：352098）
24孔板（Corning，目录号：353226）
Corning ^® HTS Transwell ^® 96孔渗透性支撑体，孔径5.0μm（Corning，目录号：3387）
96孔板，U底（Fisher Scientific，目录号：12-565-500）
1.5ml Eppendorf管（Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
流式细胞仪（圆底聚苯乙烯管，Corning，目录号：352052）
CD8 ⁺ T细胞TCR转基因小鼠，例如OT-1（C57BL/6-Tg [TcraTcrb] 1100Mjb/J，THE JACKSON LABORATORIES，目录号：003831）或Pmel-1（B6.Cg -Thy1a/Cy Tg [TcraTcrb] 8Rest/J，JACKSON LABORATORIES，目录号：005023）小鼠（8-12周龄）
TCR特异性肽
如果使用OT-1细胞 - SIINFEKL（AnaSpect，目录号：AS-60193-1）
如果使用Pmel-1细胞 - 人gp100（AnaSpec，目录号：AS-62589）
1x PBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14190144）}
重组人IL-2（Miltenyi Biotec，目录号：130-097-742）
重组鼠CXCL10（Peprotech，目录号：250-16）
AccuCheck Counting Beads试剂（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：PCB100）}
RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11875093）}
胎牛血清（Seradigm，目录号：1500-100）
非必需氨基酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11140-050）}
丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11360-070）}
HEPES（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15630-080）
β-巯基乙醇（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：21985-023）}
庆大霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15710-064）}
Hank的平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14025092）}
无蛋白酶BSA（GE Healthcare，目录号：SH30574.02）
小鼠CD16/CD32 Fc阻断抗体（BD，目录号：553142）
LIVE/DEAD ^®可固定Aqua死细胞染色试剂盒，用于405nm激发（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：L34957）。使用试剂盒
提供的50μlDMSO重构每个小瓶}
太平洋蓝缀合的抗小鼠CD3（克隆145-2C11）（BioLegend，目录号：100334）
APC缀合的CD8（克隆53-6.7）（BD，目录号：553035）
PE缀合的CXCR3（克隆CXCR3-173）（BioLegend，目录号：126506）
R10媒体（见配方）
移民媒体（见食谱）
阻塞缓冲区（见配方）
染色混合（见配方）

设备

无菌解剖工具如小型剪刀和镊子（工具可以从卡罗莱纳州或西格玛购买）
台式冷冻离心机（例如Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：Thermo Scientific ^{TM Sorvall TM} Legend ^{/sup> X1）}
孵育器（37℃，5％CO 2，95％湿度，例如Thermo Fishes Scientific，Thermo Scientific，Thermo Scientific，型号：Forma Steri-Cycle CO 2 孵化器）
组织文化罩（生物安全柜，如贝克公司，型号：SterilGARD e3）
台式轨道摇床（如Thermo Fisher Scientific，型号：Thermo Barnstead 4625 Titer Plate Shaker，目录号：THERMO BARNSTEAD 4625 TITER PLATE SHAKER-1478）
光学显微镜（如徕卡，型号：DM IL LED）
Neubauer细胞计数室（如InCyto，目录号：DHC-N01）
流式细胞仪（如BD，型号：LSRFortessa）

软件

流式细胞仪软件：DIVA
计算机分析软件：FlowJo（Treestar）

程序

获得CXCR3表达CD8 ⁺ T细胞
注意：本协议的这一步骤解释了如何在随后的步骤中生成足够数量的CD8 ⁺ T细胞。
1. 牺牲一个OT-1或Pmel-1转基因小鼠。
2. 使用锋利的剪刀和镊子在无菌条件下收集脾脏。
3. 将脾脏置于无菌6孔板的孔中，含有2ml无菌冰冷的1x PBS
4. 使用5ml注射器柱塞的背部进行麻疹脾脏。
5. 用5ml移液管收集细胞（移液管至少3次，以使细胞悬浮液均匀化），并将其通过70μm的细胞过滤器，放到50ml无菌锥形管上。
6. 用7毫升冰冷的无菌1x PBS清洗过滤器，并收集到同一锥形管上
7. 以350 x g，5分钟，4℃离心细胞。
8. 弃去上清并将细胞重悬于10ml的R10中
9. 加入1nM TCR特异性肽（SIINFEKL或人gp100，如果您使用OT-1转基因或Pmel-1转基因小鼠）。
  注意：TCR特异性肽将启动T细胞活化。
10. 在室温下孵育，在台式轨道摇床中搅拌1小时。
  注意：设置振动器速度，使锥形管内的液体在设备部分所示的轨道振动筛中移动 - 速度为3或4。
11. 加入10ml新鲜的R10（室温），并以350 x g，5分钟，4℃离心细胞。
12. 丢弃上清液并将细胞重新悬浮在50ml新鲜的R10（室温）中，补充有30U/ml的重组人IL-2。
  注意：IL-2促进T细胞扩增和存活。
13. 将细胞置于24孔板（每孔2 ml）中，并将板放在37℃，5％CO 2，95％湿度的培养箱中。
  注意：在此过程中，不需要隔离CD8 ⁺ T细胞。在TCR转基因小鼠的脾脏中发现的CD8 ⁺ T细胞的百分比约占总造血细胞的10-20％，并且它们将在下一步骤期间扩大。 >
14. 通过从每个孔中收集500μl细胞悬浮液并将它们置于新的24孔板中，每孔填充1.5ml新鲜的R10（室温），补充有30U/ml的重组人IL- 2（细胞稀释度为1〜4）。
15. 6-7天后（约2个细胞分裂），收集的细胞应超过90％CD8 + T细胞，并在其表面含有较高的CXCR3表达（请参考流式细胞术方案进行评估的CXCR3表达）。
  注意：在扩展结束之前，每个平板应该具有至少1000万CD8 ⁺ T细胞。
体外移植分析
注意：该方案的这一步骤解释了如何评估CXCL10诱导在步骤A中生成的CD8 ⁺ T细胞迁移的能力。

在50ml锥形管中收集活化的CD8 ⁺ T细胞（每片约45ml总体积），并以350xg，5分钟，4℃旋转。细胞通过每孔浸泡3-5次收集。

弃去上清液并将细胞重新悬浮在5ml的迁移培养基中。

计数单元格。

调整音量，所以你有5 x 10 ⁵细胞/100μl迁移介质。

从Transwell 96孔板中取出transwell插入片，从接受板上暴露孔

在迁移介质中制备趋化因子的稀释液，并将其加入到接受板的孔中。我们建议每个条件一式三份。
注意：接收板中的最终体积为200μl。请参阅CXCL10建议稀释方案本步骤结束时的说明。

小心地将transwell放置在接收板上。来自每个井的液体将与transwell接触。

小心地向每个transwell添加100μlCD8 ⁺ T细胞悬液（5×10 5个细胞）。关闭平板并置于37℃，5％CO 2，95％湿度的培养箱中1小时30分钟。

培养时间后，小心地将transwell板从接收板上取出。

从接收板的孔中（通过上下移动3-5次）将细胞收集到新的96孔U形底板上。我们建议使用多通道移液器执行此步骤。

旋转96 U底板，350 x g，2 min，弃上清

用封闭缓冲液（50μl/孔）重悬细胞。孵育20分钟，4度在黑暗中。

加入150μl1x PBS，旋转板350 g，2 min，弃上清。

用染色混合物（50μl/孔）重悬细胞。在黑暗中孵育30分钟，4°C。

加入150μl1x PBS，旋转板350 g，2 min，弃上清。

将细胞重悬于200μl1x PBS中

转移细胞流式细胞仪管。

向每个管中加入10μl计数珠，并在流式细胞仪中运行样品。在CD3 ⁺ CD8 ⁺ T细胞门上获得至少2,000次荧光珠门事件和2,000次事件，因为1,000个事件是准确细胞所需的最少事件数使用AccuCheck Counting Beads Kit进行计数。
注意：如果T细胞迁移是残留的（例如没有化学引诱物的条件），可能难以在T细胞门上达到所需数量的事件，但确保您可以获得最大的事件，通过运行整个样本。

流式细胞仪数据的分析使用Flow Jo软件完成。

注意：诱导活化的CD8 T细胞迁移的鼠CXCL10的浓度在10ng/ml和1,000ng/ml之间。我们建议进行2倍稀释。包括没有添加趋化因子的条件是非常重要的，以便确定非趋化因子诱导的T细胞迁移（测定的背景）。使用该方法计算迁移细胞是按照AccuCheck Counting Beads提供的说明进行的。
CXCR3内化分析
注意：该方案的这一步骤解释了如何评估CXCL10诱导趋化因子受体CXCR3内源化的能力，在CD8表面表达在步骤A中生成的T细胞
1. 将活化的CD8 ⁺ T细胞收集在50ml锥形管中，并以350xg，5分钟，4℃旋转。
2. 弃去上清液并将细胞重新悬浮在5ml的迁移培养基中
3. 计数单元格。
4. 调整音量，所以你有5 x 10 ⁵细胞/100μl迁移介质。
5. 平板细胞在96孔U底孔板（100μl/孔）中。
6. 加入100μl补充有不同浓度的鼠CXCL10（200μl总体积/孔）的迁移培养基。使用与过程B相同的浓度范围。或者，您可以进行10倍稀释，包括1,000; 100; 10;和1ng/ml。
7. 将培养箱放置在37℃5％CO 2/95％湿度的培养箱中1小时30分钟。
  注意：选择该测定的时间点（1小时和30分钟）以与在该方案的方法B中描述的迁移测定中使用的时间点相匹配。对于新的化学刺激，我们建议进行时间过程研究（例如，在与趋化因子孵育的不同时间点后评估趋化因子 - 受体内化）。
8. 培养时间后，将板旋转至350×g，2分钟，弃去上清液。
9. 用封闭缓冲液（50μl/孔）重悬细胞。孵育20分钟，4度在黑暗中。
10. 加入150μl冷的1x PBS，以350 x g的速度旋转板2 min，弃去上清液。
11. 用染色混合物（50μl/孔）重悬细胞。在黑暗中孵育30分钟，4°C。
12. 加入150μl冷的1x PBS，并将其重悬于200μl1x PBS中
13. 转移细胞流式细胞仪，每管获取至少10,000次事件
14. 流式细胞仪数据的分析使用Flow Jo软件完成。
注意：CXCR3内在化的评估可以独立完成，也可以作为CD8的一部分 T细胞迁移测定。请参阅数据分析部分，了解如何在迁移CD8中确定CXCR3水平的例子 从transwell下腔室收集的T细胞板。

数据分析

在排除碎片和死细胞（Aqua ⁺细胞）后，流式细胞术图可视化如图1所示。为了计算迁移到下腔室的T细胞数量， sup> + 细胞（红色门）和荧光珠（蓝色门），并按照珠的提供者计算细胞编号的说明。为了评估T细胞表面的CXCR3水平，将门控CD8 ⁺ T细胞作为直方图（图2）。您可以在FlowJo软件上获得平均荧光强度（MFI）的值，并将其绘制为图形。建议每个实验至少运行3次技术重复。

图1.与暴露于迁移培养基（左图）或补充有1,000ng/ml重组鼠CXCL10的迁移培养基（右图）相对应的从transwell板的接收室收集的细胞的流式细胞术图的实例）。细胞被染色，荧光计数珠（门控为蓝色）加入到细胞中，如步骤B部分所述。在此表示之前，排除了碎片和Aqua ⁺（死亡）细胞。活细胞CD3 ⁺ CD8 ⁺ T细胞以红色门控。 APC：别藻蓝蛋白。

图2.在暴露于迁移培养基之后，从transwell板的接收室收集的CD3 ⁺ CD8 ⁺ T细胞的CXCR3染色的流式细胞术直方图的实施例（黑色）或补充有1,000ng/ml重组鼠CXCL10（红色）的迁移培养基。最大染色强度百分比最大值％。 PE：R-藻红蛋白

食谱

R10媒体 - 在4°C储存1个月
RPMI 1640
10％胎牛血清 0.1mM非必需氨基酸
1mM丙酮酸钠
10 mM HEPES
70μMβ-巯基乙醇
23μg/ml庆大霉素
迁移媒体 - 为每个实验准备新鲜
1x HBSS
0.1％无蛋白酶BSA
阻塞缓冲液 - 每个条件使用50μl，为每个实验准备新鲜
1x PBS
小鼠CD16/CD32 Fc阻断抗体（以1〜50稀释使用）
可固定水性死细胞染色剂（1〜500稀释使用）
染色混合 - 每个条件使用50μl，为每个实验准备新鲜
1x PBS
太平洋蓝缀合的抗小鼠CD3（克隆145-2C11，以1至100稀释使用）
APC缀合的CD8（克隆53-6.7，以1〜400稀释使用）
PE缀合的CXCR3（克隆CXCR3-173，以1至100稀释使用）

致谢

使用此协议时，请参阅Barreira da Silva et al。。（2015）Nat Immunol。资助由巴斯德·鲁夫博士后研究金（RBdS），Ligue Contre le癌症以及法国政府的ARC pour la recherche sur le cancer（MLA）和法国政府的"未来计划投资计划"提供，由国民政府管理la Recherche（LabEx Immuno-Onco [RBdS，MLA]）。动物实验方案由巴黎的动物实验委员会（动物实验伦理委员会）批准。

参考文献

Barreira da Silva，R.，Laird，ME，Yatim，N.，Fiette，L.，Ingersoll，MA和Albert，ML（2015）。二肽基肽酶4抑制增强淋巴细胞运输，改善天然存在的肿瘤免疫和免疫治疗。 Nat Immunol 16 （8）：850-858。