材料和试剂

灭菌木棍
石蜡膜
拉链锁胶袋
13×100mm 培养管（Fisher Scientific，目录号：14-961-27）
1.5ml微量离心管（Fisher Scientific，目录号：02-681-320）
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（GE Healthcare，目录号：10600023）
X光胶片（RPI，目录号：248300）
2.0ml微量离心管（Fisher Scientific，目录号：02-681-321）
一次性塑料比色皿（Fisher Scientific，目录号：149-551-27）
手套（Fisher Scientific，目录号：19-130-1597C）
机架LTS提示
'P20'2-20μl（Mettler-Toledo，Rainin，目录号：17001865）
'P200'20-200μl（Mettler-Toledo，Rainin，目录号：17001863）
'P1000'100-1,000μl（Mettler-Toledo，Rainin，目录号：17001864）
无菌聚苯乙烯一次性血清学10ml带放大镜条的移液管（Fisher Scientific，目录号：13-678-11E）
具有无表面活性剂的醋酸纤维素（SFCA）膜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：290-3320）的Nalgene快速无菌一次性瓶顶部0.2μm过滤器}
携带编码Flag-SAMP2和TBP2-StrepII的报告质粒pJAM2201的Haloferax volcanii细胞（亲本和泛素样蛋白酶体系突变体）在P2 /sub>组成型启动子。质粒pJAM202c作为空载体对照。请参阅（Fu等人，2016）表S2所示的菌株和质粒信息。
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A7002）
新生霉素（Sigma-Aldrich，目录号：N1628）
放线菌素D（Sigma-Aldrich，目录号：A1410）
异烟霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A9789）
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：650501）
甲醇（Fisher Scientific，目录号：A413）
（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^TM，目录号：T2304）
考马斯亮蓝R-250染色溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610436）
抗体

抗StrepII多克隆抗体（小鼠）（QIAGEN，目录号：34850）
山羊抗小鼠IgG（全分子） - 碱性磷酸酶连接的抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A5153）
碱性磷酸酶连接的抗Flag M2单克隆抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A9469）

氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S642-12）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：M35-12）
硫酸钾（K 2 O 3 SO 4）（Fisher Scientific，目录号：P304-3）
氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：C79-500）
Tryptone（BD，Bacto ^TM，目录号：211705）
酵母提取物（BD，BBL，目录号：211929）
去离子H 2 O O
氢氧化钠（NaOH）（Fisher Scientific，目录号：BP359-212）
硫酸镁七水合物（MgSO 4·7H 2 O）（Fisher Scientific，目录号：M63-3）
氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：P217-3）
Tris-base（Fisher Scientific，目录号：BP152-1）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Fisher Scientific，目录号：BP166-500）
甘氨酸（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610718）
β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）
溴苯酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B5525）
丙烯酰胺（30％）（Fisher Scientific，目录号：EC890450ML）
ATCC974培养基（参见食谱）
30％（w/v）的浓盐水（SW）储备溶液（参见食谱）
2x SDS减缓缓冲液（见配方）

设备

孵化器和振荡器（42°C）（Eppendorf，New Brunswick Scientific）
SmartSpec Plus分光光度计（Bio-Rad Laboratories，目录号：1702525）
注意：本产品已停产。
离心机（Eppendorf，型号：5418）
基本电源（Bio-Rad Laboratories，目录号：1645050）
冰箱（4°C）（Frigidare）
超低温冷冻机（-80℃）（Eppendorf，New Brunswick ^{TM，型号：C660-86）}
涡旋搅拌机（Thermolyne，型号：37600）
化学通风橱（西门子，目录号：537-473）
移液管（2-20μl，20-200μl，100-1,000μl）（Rainin型LTS）
pH计（康宁，型号：320）
扫描仪（Epson，型号：3170照片）
高压釜（综合灭菌系统，型号：SR-24C-PB）
微型印迹模块（Bio-Rad Laboratories，目录号：1703935EDU）
凝胶电泳室（Bio-Rad Laboratories，目录号：1658005）
柯尼卡X光片处理器（柯尼卡美能达，型号：QX60A）
电泳系统放射自显影盒（Fisher Scientific，FisherBiotech，型号：FBXC810）
西门子Vantage反渗透系统（M21系列，西门子，型号：M21R004EA）与EVOQUA过滤器（西门子，型号：C1207098）和大西洋紫外线杀菌设备（西门子，型号：MP49）（用于产生去离子水的水净化系统） />

软件

ImageJ（imagej.net/Particle_Analysis）
Microsoft Excel（Microsoft Office 365 ProPlus）

程序

在ATCC974培养基中将Haloferax volcanii细胞生长至固定相（OD 600，2.0-3.0），并与40％（v/v）甘油无菌混合1：1。将20％（v/v）的甘油储存液储存在-80°C（长期）
通过使用灭菌的木棒将20％（v/v）甘油储液的末端接种，并将条带分离到具有ATCC974（描述于食谱部分）的补充有2％（w/v）用于固体培养基和新生霉素（0.2μg/ml）的琼脂以维持质粒DNA。用Parafilm包裹板，并转移到拉链锁塑料袋以防止水分流失。
在42℃下孵育细胞约100小时。将细胞在室温下在黑暗中储存在密封袋中的板上长达2周。
将带有质粒pJAM2201的携带菌株的分离菌落接种到具有新生霉素（0.2μg/ml）的4ml ATCC974培养基中。在液体培养基中以42rpm的速度在200rpm的旋转振荡下在13×100mm的培养管中培养细胞。
使用分光光度计监测OD 600的细胞生长。孵育约20小时后，细胞将达到对数期（OD 600> 0.4-0.7）。通过在5.1ml新鲜ATCC974培养基中将细胞传代培养至0.06的OD 600，校准对数相细胞（加入0.1ml培养基补偿由于蒸发而在生长期间的培养体积的损失）。在42℃下，在13×100mm 2培养管中，以200rpm旋转振荡，在液体培养基中培养细胞24小时以再次达到对数期。
通过使用0.2ml细胞培养物和分光光度计来确定对数相细胞的OD 600。
通过离心（10,000×10 6分钟，25℃）收获剩余的细胞，并通过在4.2ml预热浓缩盐水溶液（在方法部分中描述）中涡旋30秒来重悬细胞沉淀，达到0.7的最终OD 600。
收集1 ml细胞作为0 min样品。用20μg/ml的放线菌素D和50μg/ml的茴香霉素处理剩余的细胞。放线菌素D在加入茴香霉素后立即加入到培养基中。在42℃下在13×100mm 2培养管中以200rpm旋转振荡培养细胞。
注意：放线菌素D溶解在丙酮中以制备10毫克/升的储备溶液。将异青霉素溶于甲醇中以制备20毫克/升的储备溶液。放线菌素D和茴香霉素倾向于在高盐缓冲液中形成一些沉淀剂，涡旋溶液以完全溶解抗生素。
将1ml抗生素处理的细胞从培养管转移到1.5ml微量离心管中，每个间隔（20,40,60分钟）。通过离心（10,000×g，6分钟，4℃）立即在每个间隔收获细胞。如图1所示，通过移液小心地去除上清液，而不接触细胞沉淀。在裂解前将细胞沉淀物冷冻至-80°C。
注意：在从培养管转移之前，将培养管中的溶液涡旋10秒钟。细胞沉淀在-80℃下冷冻1-3小时，然后进一步处理样品。

图1.显示如何在不接触细胞沉淀的情况下清除上清液的图像。离心后的卤虫感染细胞以红色颗粒显示。作者建议在使用1,000μl移液管进行移液时，将小尖头放在大尖顶上。
通过在SDS还原缓冲液中上下移液来重新收获收获的细胞（在食谱部分中描述）。在该实验中，收集1ml细胞培养物，并通过SDS-PAGE在5μl样品中分析〜0.07 OD 600单位的细胞。因此，将SDS还原缓冲液的体积加入细胞沉淀物的OD 600的71.4（μl）倍。 Vol（SDS还原缓冲液）（μl）= OD 600（收获的细胞培养物）（ml）×Vol（在凝胶上加载的样品）（μl）/0.07。
将细胞悬浮液煮3次（每次5分钟，每次30秒涡旋）。
按照常规方案，通过SDS-PAGE和Western印迹分析样品（每泳道5μl）。通常，蛋白质通过12％SDS-PAGE分离，并通过湿转移电印迹到PVDF膜上。通过细胞培养物的OD 600（每道0.08 OD 600）确定等效蛋白质负载，并通过用考马斯兰染色平行凝胶来证实。通过小鼠抗StrepII多克隆抗体（1:5000稀释），然后用山羊抗小鼠IgG（全分子） - 碱性磷酸酶连接的抗体（1:10,000稀释）检测Tbp2-StrepII。通过碱性磷酸酶连接的抗Flag M2单克隆抗体（1:10,000稀释）检测Flag-SAMP。根据用户指南，使用CDP-Star与X射线胶片通过化学发光显示PVDF上的靶向蛋白质。
扫描X射线胶片，Western印迹法测定蛋白质条带的强度，并用ImageJ软件进行定量

数据分析

扫描含有蛋白质条带的X射线胶片区域以产生TIF文件。图像上的蛋白质带的定量通过ImageJ软件根据用户指南实现。通常，使用纯化的TBP2作为标准品，0.5ng至50ng蛋白质的范围作为标准曲线的范围。每个TBP2蛋白质带都包含在同一个矩形中，并绘制了峰值大小反映的信号强度。使用ImageJ软件量化蛋白质的细节可参考（ http：//www .openwetware.org/wiki/Protein_Quantification_Using_ImageJ ）。结果表示为从零开始的百分比变化，设置为1.00。例如，通过该追踪测定法测定野生型Haloferax volcanii 菌株中TBP-StrepII和Flag-SAMP2的稳定性已经在mBio（Fu >等，，2016）。代表性数据的图2最初由Fu等人发表如图S2所示。（2016）。

图2.野生型菌株中的TBP2降解。在表达Flag-SAMP2和TBP2-StrepII的野生型菌株中进行Chase测定。对照期细胞用20μg/ml的放线菌素D和50μg/ml的茴香霉素处理指定的时间并收集。分别通过抗StrepII抗体和抗Flag抗体测定TBP2和SAMP2蛋白水平。通过CB染色确认相等载量。至少在生物重复中进行实验，并显示代表性的图像。 ¥，coexpressed in trans 。该图中使用的数据集最初出版于Fu等人。（2016年）。

笔记

请注意，当细胞在标准培养条件下生长时，本研究中测量TBP2稳定性。了解引发目标蛋白质周转的环境因素，并在靶向蛋白质降解的条件下进行实验，将会强烈推荐其它蛋白质底物通过该追踪测定法进行测试。

食谱

ATCC974培养基
1. 溶解125g NaCl，50g MgCl 2·6H 2 O，5g K 2 SO 4，0.132 g CaCl 2·2H 2 O，5g胰蛋白胨和5g酵母提取物在750ml去离子H 2 O中的溶液中。当所有化学品完全溶解时，介质将显示为明确的解决方案
2. 通过加入0.5N NaOH逐滴将溶液的pH调节至6.8
3. 将解决方案的体积调整为1 L最终。将溶液转移到2×1L玻璃介质瓶（每瓶500ml）中，并在液体循环上高压灭菌25分钟
4. 储存介质在室温下长达6个月。
5. 对于携带质粒pJAM2201（和空载体对照pJAM202c）的Haloferax volcanii菌株的生长，将ATCC974培养基补充有新生霉素至终浓度为0.2μg/ml。培养基在加入抗生素前冷却至室温，立即使用，因为抗生素对高温和轻度敏感
浓度为30％（w/v）的盐水（SW）储备溶液
1. 溶解240g NaCl，30g MgCl 2·6H 2 O，35g MgSO 4·7H 2 O ，和7g KCl在650ml去离子H 2 O中的溶液
2. 向溶液中加入10ml Tris-Cl（1M，pH 7.5）将pH调节至7.4
3. 将pH调节的溶液转移到一个大的量筒上，然后用去离子H 2 O加满至1L的最终体积
4. 使用无菌一次性0.2μm过滤器对溶液进行过滤消毒。
5. 在室温下存放SW库存长达6个月
2x SDS减缓缓冲液
pH 6.8的100mM Tris-Cl缓冲液，4％（w/v）SDS，20％（v/v）甘油，0.6mg ml-1溴酚蓝和5％（v/v）β-巯基乙醇， >

致谢

这项工作由美国能源部，基础能源科学办公室，化学科学，地球科学和生物科学部，物理生物科学计划（DE-FG02-05ER15650），美国农业部国家食品和农业研究所（Hatch 1005900）和NIH |国立综合医学研究所（NIGMS）（NIH R01 GM57498-15）。

参考文献

Anjum，RS，Bray，SM，Blackwood，JK，Kilkenny，ML，Coelho，MA，Foster，BM，Li，S.，Howard，JA，Pellegrini，L.，Albers，SV，Deery，MJ and Robinson，NP 2015）。涉及真核样泛素相关修复剂在古细菌Sulfolobus acidocaldarius 的蛋白酶体途径中。 6：8163。
Fu，X.，Liu，R.，Sanchez，I.，Silva-Sanchez，C.，Hepowit，NL，Cao，S.，Chen，S.and Maupin-Furlow，J。（2016）。 MBio 7（3）。
Glickman，MH和Ciechanover，A。（2002）。泛素 - 蛋白酶体蛋白酶解途径：为了构建起到破坏作用。 82（2）：373-428。
Maupin-Furlow，JA（2014）。原核泛素 - 如蛋白质修饰。 Annu Rev Microbiol 68：155-175。
Zhou，P.（2004）。确定蛋白质半衰期，生活。方法Mol Biol 284：67-77。