材料和试剂

Falcon ^®圆底5ml聚丙烯管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352063）}
Falcon ^®圆底5毫升具有35微米细胞过滤器帽的恒定管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352235）}
APC-缀合的抗原负载的MHC II四聚体可以通过NIH Tetramer Core Facility，Emory University，USA获得。提供浓度为1-1.5mg/ml范围的四聚体，等份为200μl
装载有不相关肽（通常CLIP肽：PVSKMRMATPLLMQA可以通过NIH Tetramer核心设施，Emory University，USA获得）的APC-缀合的MHC II四聚体
小鼠抗人CD3 APC-eFluor（克隆UCHT1）（Affymetrix，eBioscience，目录号：47-0038-42）
小鼠抗人CD4 BD Horizon PE-CF594（克隆RPA-T4）（BD，BD Biosciences，目录号：562281）
（克隆RPA-T8）（BioLegend，目录号：301045）
小鼠抗人CD8亮蓝785 ^TM
小鼠抗人CD14 VioGreen ^{®（克隆TÜK4）（Miltenyi Biotec，目录号：130-096-875）}
小鼠抗人CD20 VioGreen （克隆LT20）（Miltenyi Biotec，目录号：130-096-904）
可固定的活性染料eFluor 506 ^{®（Affymetrix，eBioscience，目录号：65-0866-14）}
16％多聚甲醛（PFA）溶液（Electron Microscopy Sciences，目录号：15710）
磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10010023）}
RPMI 1604 GlutaMAX I ^{TM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：61870044）}}
HyClone ^{TM胎牛血清（FBS）（南美），研究级（GE Healthcare，目录号：SV30160.03）}
青霉素 - 链霉素（10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
1 M HEPES缓冲液（Dominique Dutscher SAS，目录号：P05-01100P）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3912）
叠氮化钠（NaN3）5％（w/v）（VWR，BDH ，目录号：BDH7465-2）
人AB血清（PAN-Biotech，目录号：P30-2901）
完成RPMI（见配方）
FACS缓冲区（见配方）
四聚体标记缓冲液（见配方）
FACS排序缓冲区（见配方）

设备

台式离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall ^TM Legend ^TM XTR）
台式微量离心机（Eppendorf，型号：5254 R）
BD LSRFortessa ^{TM细胞分析仪（BD，BD Biosciences，型号：BD LSRFortessa ^{TM细胞分析仪）}}
流式细胞仪（BD，BD Biosciences，型号：BD FACSAria II 细胞分选机）的BD FACSAria II ^TM

软件

FACSDiva ^TM版本8.0（BD）
FlowJo ^TM版本10.2（FlowJo，LLC）

程序

HIV感染患者CD4 + sup + T细胞的体外四聚体标记

来自HIV感染样本的PBMC或者从冷冻小瓶中解冻，或者在生物安全3级环境中全血新鲜处理。
将15-50×10 6个细胞分配到5ml聚丙烯管（每管5×10 6个细胞）中，并用2ml完全RPMI在600℃洗涤一次，在4℃下，xg 7分钟。
注意：
1. 洗涤需要加入指定体积的指定的洗涤缓冲液，然后离心并仔细去除上清液。
2. 每个四聚体标记需要至少5×10 6个/个PBMC;控制四聚体标签需要相同数量的PBMC。当放大时，优选并行处理多个相同的样品管，使得对照管所需的细胞数量保持恒定在5×10 6个PBMC。 >
3. 在50μlFACS缓冲液中含有0.5×10 6个细胞的单个管应在此阶段制备，用作单染色补偿对照。这些管应保持在4℃持续四聚体标记的持续时间，直到细胞表面抗体加入点。
去除上清液，将细胞沉淀重新悬浮在100μl预冷的四聚体标记缓冲液中并置于冰上。
装载有验证的HIV-1肽或不相关对照肽（CLIP）的MHC II四聚体的溶液在4℃以全速旋转5分钟以除去蛋白质聚集体。
注意：在使用MHC II四聚体溶液之前，请先转载背景标签。
将APC-缀合的四聚体以每10 6个细胞（即，每管5μg）1μg加入细胞悬液中。
重要信息：含有5×10 6个细胞的一条细胞必须用装有不相关肽（CLIP）的四聚体进行标记，并用作四聚体标记的阴性对照。
四聚体标记在0-4℃下进行60分钟，防止光照。
注意：在寒冷条件下染色有助于减少背景;然而，这些条件仅适用于检测高亲合力pMHC/TCR相互作用。
将如下针对细胞表面标志物的抗体混合物加入到每个管中（v/10 ^{6个细胞）：1μlCD3 APC-eFluor 780; 0.5μlCD4 PE-CF594; 0.5μlCD8 BV 785; 3μlCD14-VioGreen; 3μlCD20-VioGreen和0.5μl可固定活性染料eFluor 506。
注意：此时可以添加细胞表面表型的其他抗体。

此时，在50μlFACS缓冲液中含有0.5×10 6个细胞的管子用单独的抗体单独标记以用作补偿对照。对于AmCyan-dump通道（包括CD14-VioGreen; CD20-VioGreen和Fixable Viability Dye eFluor 506），在50μlFACS缓冲液中含有0.5×10 6个细胞的单管用1.5μlCD14 -VioGreen。}
将细胞与抗体混合物在4℃下在黑暗中进一步温育30分钟
流式细胞仪分析
1. 标记的细胞用（预冷）FACS缓冲液洗涤两次，并用在PBS中稀释的2％PFA固定。
  注意：固定需要在离心后完全去除上清液，并在400μl固定液中重新悬浮。
2. 管中的所有细胞在流式细胞仪（LSR Fortessa）上获得。
用于细胞分选
1. 标记的细胞用FACS分选缓冲液洗涤一次，并将细胞浓度在FACS分选缓冲液中调节至每毫升10×10 6个细胞。
2. 使用细胞 - 过滤器帽过滤细胞以获得单细胞悬浮液。随后，将所有细胞在安装在微生物安全柜中的细胞分选仪（FACSAria II）上获得。
可行的四聚体标记的CD4 + T细胞在可行的CD3 ^{+，> CD4 +，CD14 -/- CD20 ^-，CD8 ^-淋巴细胞门（参见门控策略，图1A）。}
根据阴性对照设置门，其中包含CLIP-负载四聚体标记的CD4 ⁺ T细胞（图1B）。

图1.来自患者PBMC的活的HIV特异性CD4 ⁺ T细胞的体外检测。 A.门控策略：转储通道包括以下抗体：CD14-VioGreen，CD20-VioGreen和存活性染料-EFluor506.BFACS图描绘来自HIV-1感染患者的CD4 + sup + T细胞，其用HLA DRB5 * 0101四聚体标记，（左侧）或具有免疫显性HIV-1 Gag肽[FRDYVDRFYKTLRAEQASQE]（右）的对照CLIP肽[PVSKMRMATPLLMQA]（左）。

数据分析

流式细胞术数据用Flowjo v10.2软件（FlowJo，LLC。）分析。

食谱

完成RPMI
440 ml RPMI 1640
50ml FBS
5 ml青霉素 - 链霉素
5 ml HEPES
FACS缓冲区（1 L）
982 ml 1x PBS
10克BSA
18毫升5％（w/v）叠氮化钠
四聚体标记缓冲液（1 ml）
850μlRPMI（无FBS）
150μl人类AB血清
FACS分选缓冲液（50ml）
49.5ml 1x PBS
0.5 ml FBS

致谢

该协议由Benati等人改编。（2016年）。我们承认来自国际老年痴呆症患者（ANRS EP36-8）和国民健康计划（ANR PD1VAX）的资助。

参考文献

Benati，D.，Galperin，M.，Lambotte，O.，Gras，S.，Lim，A.，Mukhopadhyay，M.，Nouel，A.，Campbell，KA，Lemercier，B.，Claireaux，M.，Hendou ，S.，Lechat，P.，de Truchis，P.，Boufassa，F.，Rossjohn，J.，Delfraissy，JF，Arenzana-Seisdedos，F.and Chakrabarti，LA（2016）。< a class = ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27111229"target ="_ blank">公共T细胞受体赋予HIV控制器高亲和力CD4反应。 em> J Clin Invest 126（6）：2093-2108。
Seth，N.，Kaufmann，D.，Lahey，T.，Rosenberg，ES和Wucherpfennig KW（2005）。< a class ="ke-insertfile"href ="https：//www.ncbi.nlm.nih .VV/pubmed/16272355"target ="_ blank">病毒血症短暂的艾滋病毒特异性CD4T细胞的扩张和收缩，但具有持续病毒复制的大多数这些细胞的物理损失。 J Immunol 175（10）：6948-58。