材料和试剂

正常兔IgG
RIP认证的抗体（NBL，目录号取决于您要定位的目标）
NaCl
MgCl 2
Nonidet P40
NaoAc
蛋白A珠（GE Healthcare Dharmacon，目录号：17-0780-01）或Protein G珠（Thermo Fisher Scientific，目录号：22852）
乙醇（分子生物学级）
2-丙醇（分子生物学）
无核酸酶的PBS
无核酸酶水溶液
同种型对照IgG（如有必要）
Digitornin
抑肽酶（终浓度10μg/ml）
亮肽素（5μg/ml）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（终浓度0.5mM）
RNase抑制剂（Life Technologies，Invitrogen TM，目录号：10777-019）
二硫苏糖醇（DTT）（还原剂）
裂解缓冲液（见配方）
洗涤缓冲液（NT2）（参见配方）
注意：附加缓冲液准备（参见配方）

设备

微量离心机能够处理15,000个电子邮件
微量离心管（1.5ml或2ml）（不含核酸酶）（建议;使用低附着管RIP-测定）
离心机能够2,000 x g
离心管（15ml或50ml）
移液管（5ml，10ml，25ml）（不含核酸酶）
移液管吸头（10μl，20-100μl，200μl和1,000μl）（不含核酸酶）（推荐使用RIP-Assay的低附着力吸头）
超低温冰箱（-80℃）
冰柜（-20°C以下）
端到端旋转器
涡流搅拌器
手套

程序

抗体固定的蛋白A或蛋白G琼脂糖珠的制备第1天
1. 在DEPEC处理的水中的以下组分是最终浓度 50mM Tris（pH7.5） 50mM NaCl 1mM MgCl 2
  0.05％Nonidet P40
2. 用NT2缓冲液洗涤珠子。如果你有4个样品，你需要取100微升的珠子每个Eppendorf管，共4管。 3,600rpm，在4℃下1分钟，除去上清液。用200μlNT2缓冲液洗涤3次
3. 向每个管中加入30μg靶抗体（例如来自NBL的HuR1μg/μl）
4. 每管加入320μlNT2缓冲液。夜间在4℃下旋转。
第2天
1. 在4℃下将管（Ab +珠）离心5000×g 5分钟。丢弃上清液用新鲜制备的NT2缓冲液1ml洗涤两次。最后一次洗涤后，暂时保留上清液，放在冰上，直到细胞裂解液准备好。
哺乳动物细胞裂解
1. 准备细胞沉淀：
  1. 如果需要，通过吸液或使用细胞刮刀从培养皿中分离细胞。收集细胞悬浮液在离心管中。
  2. 在4℃下将细胞悬浮液以300×g离心5分钟以沉淀细胞。小心取出并弃去上清液。
  3. 通过用冰冷的PBS重悬细胞沉淀来洗涤细胞。
  4. 在4℃下将细胞悬浮液以300×g离心5分钟以沉淀细胞。小心取出并弃去上清液。
  5. 使用步骤3-4再次洗涤细胞。
  6. 通过用冰冷的无核酸酶的PBS重悬细胞沉淀来洗涤细胞。
  7. 在4℃下将细胞悬浮液以300×g离心5分钟以沉淀细胞。小心取出并弃去上清液。
  8. 通过用冰冷的无核酸酶的PBS重悬细胞沉淀来清洗细胞
  9. 等分细胞悬浮液到每个新的微量离心管。
  10. 在4℃下将细胞悬浮液以300×g离心5分钟以沉淀细胞。小心取出并弃去上清液。
2. 裂解细胞沉淀
  1. 在最终以下浓度的DEPEC处理水中制备RSB缓冲液 10mM Tris（pH7.5） 100 mM NaCl
    2.5mM MgCl 2 v/v 然后在每ml RSB缓冲液中加入其他补充剂。
    10μldigitornin/ml缓冲液（Digitornin新鲜溶于乙醇4mg/ml），3μlRNA酶抑制剂/ml缓冲液，40μl蛋白酶抑制剂混合物/ml。
  2. 加入200微升的RSB缓冲液到每个细胞沉淀。在冰上2分钟。离心机4,400rpm 4℃，8分钟。
  3. 为每个管（Ab +珠）制作753μl主混合物。对于4管，你可以做4.5倍以上 700μlNT2缓冲液
    10μl0.1M DTT
    10μlRNA酶抑制剂
    33μl0.5M EDTA（pH8）
  4. 然后将细胞裂解物的每个上清液加入管（Ab +珠）。在4℃下旋转2小时
  5. 从混合物中取20μl的蛋白质印迹。离心管在5,000×g 4℃2分钟。
  6. 弃去上清液。用1ml NT2缓冲液在5,000xg 4℃2分钟洗涤沉淀两次。
  7. 进一步处理混合物以获得mRNA。使DNAase主混合现在我们有4个管，所以做4.5倍主混合 100μlNT2缓冲液×4.5 =450μl
    5μlDNA酶（2U /μl）×4.5 =22.5μl
    每管加入105μlDNAase主混合物，37℃，10分钟孵育
  8. 然后在4℃下加入1ml NT2缓冲液离心机5000×g 5分钟。除去上清液。
  9. 添加蛋白酶K（20毫克/微升）主混合103微升到每个管。 55℃，15分钟加混合主混合物：2.5μl蛋白酶K x 4.5 =11.25μl
    0.5μl20％SDS×4.5 =2.25μl
    100μlNT2缓冲液×4.5 =450μl
  10. 离心机5,000×g <4℃5分钟。
  11. 收集100μl上清液到新的Eppendorf管。加入200μl的NT2缓冲液到老管，离心5000×g 4℃，再次5分钟。收集200微升的上清液，并集中到新的管，这变成300微升的上清
  12. 向上清液中加入等体积的酸性苯酚/氯仿顶点1分钟，然后离心1分钟RT，13k rpm
  13. 收集约250μl水相（上相）
    加入：25μl3M NaoAc（pH 5.5）
    625μl100％乙醇
    3微升糖原蓝
    充分混合，-20℃或以下放置20分钟（如有必要，过夜）
  14. 在4℃下以12,000×g离心管10分钟，然后小心地抽吸上清液。
  15. 在4℃下用1ml 70％乙醇冲洗，13,000×g 2分钟。弃去上清液。倒置管，空气干燥5分钟。沉淀是mRNAs

食谱

裂解缓冲液
在使用前，向裂解缓冲液中加入适当浓度的蛋白酶抑制剂，RNA酶抑制剂和DTT。含有这些试剂的裂解缓冲液在以下方案中被描述为裂解缓冲液（+）。用于RIP-测定的每种试剂的最佳浓度如下所示在DEPEC处理水中制备RSB缓冲液，最终浓度如下：
10mM Tris（pH7.5） 100 mM NaCl
2.5mM MgCl 2 v/v 然后在每ml RSB缓冲液中加入其他补充剂。
10μldigitornin/ml缓冲液（digitornin溶于乙醇4mg/ml新鲜），3μlRNA酶抑制剂/ml缓冲液，40μl蛋白酶抑制剂混合物/ml。
洗涤缓冲液
恰好在使用前向洗涤缓冲液中加入最终1.5mM DTT。含有DTT的洗涤缓冲液在以下方案中称为洗涤缓冲液（+）在DEPEC处理水中制备洗涤缓冲液，最终浓度如下：
50mM Tris（pH7.5） 50mM NaCl 1mM MgCl 2
0.05％Nonidet P40
注意：附加缓冲液准备
在一些情况下，裂解缓冲液（+）和洗涤缓冲液（+）都可能需要加入适当体积的高盐溶液（在这些情况下，向每ml裂解缓冲液中加入30μl高盐溶液，缓冲区）。

致谢

该协议改编自NBL RIP-测定试剂盒（参见参考文献1）。

参考文献

来自NBL RIP-测定试剂盒（NBL，目录号：RN1001）的方案。