材料和试剂

移液器提示
2-100μl（Eppendorf，目录号：0030000.870）
50-1,000μl（Eppendorf，目录号：0030000.919）
1-10 ml（Eppendorf，目录号：0030000.765）
2.0ml微管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-200-C）
pH测试条（0.0-6.0 pH）（Sigma-Aldrich，目录号：P4661）
1.5ml微管（Corning，Axygen ，目录号：MCT-150-C）
50ml离心管（Corning，目录号：430829）
Acrodisc ^® MS注射器过滤器（0.2μm，13 mm，WWPTFE膜）（Pall，目录号：MS-3301）
BD具有可拆卸针头的结核菌素注射器（1ml，27G×1/2英寸）（BD，目录号：309623）
1.5 ml半微量比色皿（AS ONE，目录号：1-2855-02）
HPLC螺旋盖小瓶（Agilent Technologies，目录号：5182-0714）
400μl聚丙烯平底插入物（Agilent Technologies，目录号：5183-2087）
Zorbax Eclipse XDB-C18反相柱（Analytical，4.6 x 150 mm，5-micron）（Agilent Technologies，目录号：993967-902）
无菌培养皿（90毫米）（Sartorius，目录号：14-555-735）
X oo X strain>>>>>> strain which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which which>>>>/em>等，，2016）
头孢氨苄（Sigma-Aldrich，目录号：1099008）
DSF（顺式-11-甲基十二碳烯酸）（HPLC级，纯度≥90.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：42052）
BDSF（顺式-2-十二碳烯酸）（HPLC级，纯度≥90.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：49619）
6N盐酸溶液（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：13-1686）
乙酸乙酯（ACS试剂级，纯度≥99.5％）（Sigma-Aldrich，目录号：676810）
甲醇（HPLC级）（Fisher Scientific，目录号：A452-4）
磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5368）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：49781）
细菌蛋白胨（BD，Bacto ^TM，目录号：211677）
Bacto牛肉提取物（BD，Bacto ^TM，目录号：211520）
蔗糖（Vetec ^TM试剂级）（Sigma-Aldrich，目录号：V900116）
BBL酵母提取物（BD，BBL，目录号：211931）
NaOH
琼脂（BD，目录号：281230）
乙酸钠（ACS试剂级，纯度≥99.0％）（Sigma-Aldrich，目录号：791741）
乙酸（ACS试剂级，纯度≥99.7％）（Sigma-Aldrich，目录号：695092）
无菌去离子H 2 O O
甘油粉（见配方）
营养汤（NB，见食谱）
营养琼脂（NA，见食谱）
0.2 M醋酸钠溶液（pH 8.0）（见配方）
0.2 M乙酸溶液（pH 2.7）（见配方）
0.2 M醋酸钠缓冲液（pH 3.8）（见配方）
头孢氨苄储备液（20 mg/ml，见食谱）

设备

Corning ^®玻璃锥形瓶带螺帽
50毫升（康宁，目录号：4985-50）
250毫升（康宁，目录号：4985-250）
MaxQ ^{TM TM} 6000孵育/冷冻振荡器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：MaxQ ^{TM，目录号：SHKE6000-8CE）}}
紫外可见分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：BioMate ^{TM 3S）}}
微量离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Sorvall TM} Legend ^TM Micro 17R）
离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM型号：Heraeus ^TM Multifuge ^TM X1R）
涡街搅拌机（VWR，目录号：10153-840）
带玻璃盖的CentriVap台式浓缩机（Labconco，目录号：7810040）
移液器
10-100μl（Eppendorf，目录号：3120000046）
100-1,000μl（Eppendorf，目录号：3120000062）
1-10ml（Eppendorf，目录号：3120000089）
通风柜
冰箱（MEILING BIOLOGY& MEDICAL，型号：DW-YL270）
与锥形微尖头探针（尖端直径：3mm）连接的高强度超声波液体处理器（Sonics& Materials，型号：VCX 500）（Sonics& Materials，目录号：630-0422 ）
数字精密水浴（DAIHAN Scientific，型号：WB-6）
梨形玻璃烧瓶，Ts 29/38，100ml（Tokyo Rikakikai，EYELA，目录号：116150）
UPLC/MS系统
超精密液相色谱系统（UPLC）（Agilent Technologies，型号：Agilent 1290 Infinity LC）与准确的质量飞行时间（TOF）MS（Agilent Technologies，型号：Agilent 6230 Accurate-Mass TOF MS）配合安捷伦喷射流（AJS）电喷雾离子化（ESI）源
二极管阵列检测器（Agilent Technologies，型号：G4212A）
pH计（Mettler Toledo，型号：FE20）
隔膜真空泵（Labconco，目录号：7393001）
旋转蒸发器（东京Rikakikai，EYELA，型号：N-1100）
循环冷却水系统（东京Rikakikai，EYELA，型号：CCA-1111）
高压釜（Panasonic Healthcare，型号：MLS-3781L）

软件

安捷伦MassHunter工作站数据采集软件（修订版B.04）

程序

预培养物的制备（用于所有后续培养条件）
1. 来自-80℃的NA板上的添加有头孢氨苄的终浓度为20μg/ml的甘油原液的菌株ΔxpfB。
2. 将板在28℃孵育4天以获得单个菌落。
3. 用移液管吸头，分离一个ΔrpfB菌落，并在50ml锥形瓶中接种10ml补充头孢氨苄的终浓度为20μg/ml的NB。
4. 在28℃下，在MaxQ<> 6000培养的/冷冻振荡器中以200rpm摇动36小时孵育Δ rpfB 培养物。
准备文化
1. 在分光光度计中测量1:4稀释的ΔrpfB预培养物的600nm（OD 600）的光密度，并通过以下方法计算预培养的光密度：将测量的读数乘以4（稀释比）。
2. 使用NB将预培养物的OD <600>调整到约1.0。
3. 在50ml排气帽的锥形烧瓶中加入1ml调整后的ΔrpfB预培养液至50ml营养肉汤（1:50稀释）。
4. 将培养物在28℃下以200rpm摇动孵育36-48h，直至达到DSF/BDSF提取的早期固定相（OD 600> 2.8-3.0）。
  注意：如果检测到其他细菌菌株，则应优化其他特定生长条件。
细胞外DSF/BDSF提取
1. 在2ml离心管中分配4mlΔrpfB培养物，并以8,000xg离心15分钟，得到细胞外DSF/BDSF提取的培养上清液。 />
2. 将上清液转移到两个新的2ml微量管中，通过加入足够的体积（通常为15至20μl）的6N盐酸并用测试条监测pH变化，将其pH调节至3.0-3.5。
3. 将上清液分配在8个2ml微管（每管0.5ml）中，然后向每个管中加入1ml乙酸乙酯。
4. 以最高速度旋转微管5分钟以提取DSF和BDSF分子，并以8,000 x g离心10分钟，从乙酸乙酯部分中分离出水分。
5. 小心地将乙酸乙酯部分（上层）收集到四个1.5ml微量管中，通过移液并在CentriVap台式浓缩器中在40℃下蒸发溶剂以完成干燥（约20分钟）。
6. 在四个1.5ml微量管中分配0.15ml甲醇，并剧烈旋转微管30秒，这确保所有残余物被再溶解。
7. 将微管以2,000 x g离心1分钟，然后使用移液管将每个微管的萃取溶液转移到新的1.5 ml微量管中。
8. 在CentriVap台式浓缩器中在40°C下蒸发溶剂以完成干燥（约40分钟）。
  注意：
  1. 此时，样品可以在-20℃下冷冻以备后续步骤，或者如以下步骤所述立即进行分析。
  2. 为了防止吸入挥发性溶剂，本节中的步骤C3至C8应在通风橱中进行。
细胞内DSF/BDSF提取
1. 在50ml离心管中倾倒40ml△rpfB培养物，并通过在4℃以8,000×g离心15分钟收获细菌细胞。
2. 丢弃上清液，并在管中加入40 ml的1x PBS缓冲液，轻轻移液以洗涤细胞沉淀
3. 弃去上清液并通过在4℃以8,000 x g离心15分钟收集洗涤的细菌细胞。
4. 将细胞沉淀重新悬浮在10ml冰冷的乙酸钠缓冲液（pH 3.8）中
5. 将再悬浮溶液在-20°C冷冻箱中冷冻1小时，然后将细菌悬浮液在室温下孵育30至60分钟，以完全解冻悬浮液。
6. 轻轻移取解冻的细菌悬浮液使细胞匀浆。
7. 再次重复步骤D5和D6。
8. 超声处理细胞匀浆6分钟，超声处理3秒，暂停4秒，并使用Vibra细胞^{TM在冰上重复该超声/暂停循环120次（振幅设定在20％）。高强度超声波液体处理器与锥形微尖头探针（直径3mm）连接。}
9. 将含有经处理的细胞裂解物的离心管转移到95℃的水浴中5分钟以使总蛋白质变性。
10. 通过在4℃以8,000 x g离心15分钟将可溶性裂解液与细菌细胞碎片分离。
11. 离心后，立即用可移液管将可溶性裂解液（透明部分）转移到250ml锥形玻璃烧瓶中。应仔细执行此操作，以避免干扰管底部的沉淀物
12. 在烧瓶中加入20ml乙酸乙酯，并立即用盖子关闭烧瓶，以避免挥发性溶剂的蒸发和溢出。在MaxQ< sup><>
13. 将提取混合物转移到50ml离心管中，并以6,000 x g离心10分钟，从乙酸乙酯部分中分离出来。
14. 通过仔细移液将乙酸乙酯部分（上层）转移到100ml梨形玻璃烧瓶中
15. 通过40°C旋转蒸发除去溶剂，以完成干燥（约5分钟）
16. 将1ml甲醇分配到梨形玻璃烧瓶中，通过移液多次重新溶解残留物
17. 将溶液转移到1.5 ml微量管中，并将CentriVap台式浓缩器中的溶剂在40°C下蒸发，以完成干燥。
  注意：
  1. 此时，样品可以在-20°C下冷冻以备后续步骤，或按照以下步骤所述进行立即分析。
  2. 为了防止吸入挥发性溶剂，本节中的步骤D12至D17应在通风橱中进行。
LC/MS样品制备
1. 粗提取样品可以通过以最高速度向1.5ml微管风扇中加入200μl甲醇而得到。
2. 为了去除样品中的任何不溶性颗粒，通过与1 ml一次性注射器连接的MS注射器过滤器（0.2μm）过滤粗样品。在一个新的1.5 ml微管中收集过滤的样品（约100μl）
3. 使用移液管将60μl过滤的样品转移到装有平底插入物的色谱柱中。盖上小瓶。样品现在可以进行LC/MS分析。
LC/MS程序
1. 使用HPLC级甲醇（洗脱剂B） - 水（洗脱液A）（80:20，v/v）作为流动相。
2. 将柱温保持在30℃，流速为0.4ml/min
3. 平衡色谱柱15分钟或更长时间，直到基线稳定。
4. 使用Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱将5μl等分试样的样品注入Agilent 1290 Infinity UPLC。
5. 使用二极管阵列检测器（Agilent G4212A）检测DSF和BDSF分子，其设置为波长为220 nm，带宽为4 nm。
6. 然后将样品以负电离模式注入AJS ESI离子阱陷阱质谱仪。
7. MS源参数如下：

数据分析

使用Agilent MassHunter工作站数据采集软件（版本B.04）以质心模式获取数据。色谱图的单个质量（m/z）扩展为20.0 ppm对称。典型的质谱如图2-4所示

对于[BDSF-H] ^-检测，将单同位素精确值（ m/z ）设置为197.1547（图2）
对于[CDSF-H] ^-检测，将单同位素精确值（ m/z ）设置为209.1547（图3）。
对于[DSF-H] ^-和[IDSF-H] ^-检测，将单同位素精确值（ m/z ）设置为211.1704图4）。

图2. BDSF的典型质谱。A.溶解ΔrpBB培养上清液的乙酸乙酯提取物中BDSF的提取离子色谱图（计数与采集时间）在甲醇（20倍浓缩）中，y轴表示电离分子的计数（绝对丰度），x轴表示保留时间。 BDSF（计数与质荷比[m/z]]的MS分析显示[BDSF-H] ^{的197.1543Da的精确分子量（z = 1） -}（主峰），其确定BDSF的确切分子量为198.1547。 y轴表示电离分子的计数（绝对丰度），x轴表示从上图中的BDSF峰获得的离子化分子的质量 - 电荷（m/z）（图A）

图3. CDSF的典型质谱图A.溶解ΔrpBB培养物上清液的乙酸乙酯提取物中CDSF的提取离子色谱图（计数与获取时间）在甲醇（20倍浓缩）中，y轴表示电离分子的计数（绝对丰度），x轴表示保留时间。 CDSF（计数与质荷比[m/z]]的MS分析显示[CDSF-H] ^{的209.1547Da的精确分子量（z = 1） -}（主要峰），其确定CDSF的确切分子量为210.1547。 y轴表示电离分子的计数（绝对丰度），x轴表示从上图中的CDSF峰获得的离子化分子的质量 - 电荷（m/z）（图A）

图4. DSF和IDSF的典型质谱图A.在ΔrpBB培养上清液的乙酸乙酯提取物中提取的DSF和IDSF的离子色谱图（计数与获取时间）/em>溶解在甲醇（20倍浓缩）中，其中y轴表示电离分子的计数（绝对丰度），x轴表示保留时间。 DSF（计数与质荷比[m/z]]的MS分析显示[DSF-H] ^{的211.1700Da的精确分子量（z = 1） -}（主要峰），这决定了DSF的确切分子量是212.1704。 y轴表示电离分子的计数（绝对丰度），x轴表示从顶板中的DSF峰获得的离子化分子的质荷比（m/z ）图A）。 C. IDSF的MS分析（计数与质量/质量比）显示[IDSF-H] ^{的211.1704Da的精确分子量（z = 1） -}（主峰），其确定IDSF的确切分子量为212.1704。 y轴表示电离分子的计数（绝对丰度），x轴表示从顶板中的IDSF峰获得的离子化分子的质荷比（m/z ）（图A）

整合和量化峰值区域。
通过绘制峰面积与已知浓度来绘制DSF或BDSF的标准曲线。示例标准曲线如图5所示，其中使用浓度为1μM，5μM，10μM和50μM的DSF或BDSF标准（ Zhou 等，。，2015b ）。 /> 注意：由于IDSF和CDSF不能在市场上销售，所以在以前的研究中没有创建这两种信号分子之一的标准曲线。

图5.通过测量不同浓度的BDSF（A）和DSF（B）的峰强度（PI）构建的示例标准曲线（ Zhou等等。，2015b ）< br />
使用标准曲线的斜率和y截距来计算样品中DSF或BDSF的浓度。数据可以进一步标准化为细胞计数，以确定必要时每个细胞的DSF和BDSF的量

笔记

该协议经过优化，用于测量Xoo 中的DSF系列信号电平。对于其他细菌，使用适当的生长培养基，抗生素和生长条件
在Xoo中生产DSF系列QS信号是增长相位依赖的。 Xanthomonas 的 rpfB 基因在晚期固定期内参与体内DSF家族信号转换（Wang等人 >，2016; Zhou 等人，，2015b）。含有功能性RpfB的Xoo 菌株产生的最高水平的DSF家族信号仅存在于早期固定期，此后迅速降低;而缺失突变体突变体在生长期间累积DSF家族信号（Wang等人，2016）。因此，为了测量Xoo 细胞中的DSF家族信号，必须在适当的生长阶段（早期固定阶段）收集Xoo样品，特别是对于那些具有功能性RpfB的菌株。
由于质谱是非常敏感的技术，建议DSF/BDSF缺陷菌株作为DSF/BDSF提取和定量在每个实验中的阴性对照。例如，可以将Xoo 的DSF/BDSF缺陷型突变体ΔxpfF用作对照样品。
提取前的酸化是本协议中DSF/BDSF提取的关键步骤。确保培养上清液酸化（pH小于4.0）

食谱

甘油储备一个小瓶
150μl87％甘油 500微升Xoo 过夜文化
营养肉汤（1升）
5克Bacto蛋白胨
3克Bacto牛肉提取物
10g蔗糖
1克BBL酵母提取物
使体积达到1 L，dH <2> O，并用NaOH调节pH至6.8
通过在115℃下高压灭菌20分钟来消毒培养基
营养琼脂（200毫升）
将3克琼脂加入200毫升营养液中通过在115℃下高压灭菌20分钟来消毒培养基
0.2M乙酸钠溶液，pH 8.0（100ml）
将1.64g乙酸钠溶解在100ml dH 2 O中，//
0.2M乙酸溶液，pH 2.7（100ml）在98.85 ml dH 2 O中分配1.15 ml乙酸
0.2M乙酸钠缓冲液，pH 3.8（100ml）
12ml 0.2M乙酸钠溶液
88ml 0.2M乙酸溶液
头孢氨苄储备溶液（1 ml）
将20mg头孢氨苄粉末溶解在1ml无菌dH 2 O中，过滤灭菌

致谢

该协议适用于Zhou等人。（2015b）和Wang等人。（2016）。
这项工作得到了中国国家重点研究发展计划（2016YFE0101000至ZL）和国家自然科学基金（中国国家自然科学基金资助项目31471743号，第3034344号至ZL）的研究资助。

参考文献

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