材料和试剂

微量离心管（1.5ml）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：3456）}
5毫米NMR管（Norell，目录号：XR-55 -7）
硫酸软骨素A（来自牛气管）（Sigma-Aldrich，目录号：C8529）
硫酸皮肤素（Sigma-Aldrich，目录号：C3788）
硫酸软骨素C（来自鲨鱼软骨，含有〜10％硫酸软骨素A）（Sigma-Aldrich，目录号：C4384）
硫酸肝素（来自猪粘膜）（Celsus Laboratories，目录号：HO-03103）
肝素（来自猪粘膜）（新西兰制药，批号：5108356）
肝素（来自猪粘膜）（新西兰制药，批号：BX-090-010）
氧化氘（99.9原子％）（剑桥同位素实验室，目录号：DLM-4-100）
叔丁醇（叔丁醇，ACS试剂）（Sigma-Aldrich，目录号：360538）

设备

NMR光谱仪（Bruker，型号：Bruker Avance DPX-500）
冷冻干燥机（Eyela，型号：FD-1）
移液器（0.5-10μl，20-200μl和100-1,000μl）（Eppendorf）

软件

软件Topspin 2.6

程序

样品制备
在NMR分析之前，将样品中的可交换质子处理为氘交换方案：
1. 将D 2 O（1ml）加入到在Eppendorf管中的葡糖胺聚糖的样品（〜12mg）中，并搅拌样品以完全溶解。
2. 将样品在"松散封闭"管中冷冻干燥，此过程重复两次。
3. 最后，将样品与含有0.2mg/ml-t-BuOH的D 2 O（0.7ml）作为内标（δ¹ H 1.24ppm），并转移到NMR管中进行分析
样品浓度
已经发现17mg/ml的浓度是高度可重现的2维NMR所必需的最小值。这类化合物的<1/1H NMR谱显着受pH，可交联的物质（例如，Ca 2+）的影响，和硫酸盐部分的盐形式（Liu et al。，2009; Guerrini等人，2008）。如果怀疑这种污染物，则应在冷冻干燥和氘转化之前，将样品转化为钠盐并透析（3,500MW截止）以防止水分残留。
数据收集

在三通道Bruker Avance III 500（安装于2007年8月）的30℃下收集光谱。质子频率为499.843MHz，探针是配备有主动屏蔽的50-G/cm Z轴脉冲场梯度（PFG）的Bruker双通道5-mm宽度观察核探针（31P-109Ag）。
数据采集采用10,302Hz，65,536个数据点，30度激励脉冲，32个瞬变的频谱宽度，每个具有2秒延迟时间和1.59秒的FID采集时间。
记录具有溶剂抑制的光谱：低功率连续波预饱和后，使用"zgcppr"Bruker序列（软件Topspin 2.6）的复合观察脉冲。

数据分析

单独的GAG可以通过其独特的1 H NMR谱（图1）来识别。硫酸乙酰肝素或肝素样品中污染的软骨素或硫酸皮肤素的存在通过检测糖胺聚糖乙酸盐共振是显而易见的（Carnachan，2016）。对于肝素和硫酸乙酰肝素，这种乙酸盐共振发生在δ2.034ppm，任何另外的乙酸盐共振下场表明存在其他GAG（见图2）。此外，肝素和硫酸乙酰肝素在δ3.25,3.37和> 5.0 ppm，将其与软骨素或皮肤病区分开来。

图1. 1 H NMR谱（D 2 O，25°C，具有HDO抑制，参考-TuOH）肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和硫酸皮肤素。软骨素A是软骨素A和C的混合物。

参考图1所示的乙酸甲酯共振（D 2 O，25℃，HDO抑制）的1 H NMR谱，参考<肝素，硫酸乙酰肝素，硫酸软骨素和硫酸皮肤素。软骨素A是软骨素A和C的混合物。
通过证明，从Heparanoid纯化过程中记录的那些（参见注释6）的典型的1 H NMR谱见图3。

图3.从DEAE-Sepharose色谱分离得到的类肝素和部分纯化级分的1 H NMR谱。A.非常粗的具有显着蛋白质贡献的肝素类; B.肝素 - 不同批次A; C和D.GAG混合物具有相当大比例的肝素样物质; E.分数> 85％HS（D 2 O，25°C，具有HDO抑制[δ4.6ppm的不连续峰），参考于-BuOH）。
肝素和硫酸乙酰肝素N-乙酸甲酯共振在δ2.034ppm处的共同发生使用该峰来评估这些物质在样品中的相对比例是有问题的。然而，相对于光谱的其余部分，该峰的强度可以指示样品是否更多是硫酸肝素样，或更多的肝素样。肝素的乙酸盐共振的峰高相当于在δ〜3.8ppm处观察到的次甲基共振的峰高，而对于硫酸乙酰肝素，乙酸盐共振比次甲基共振大约2.5倍（参见图2）。硫酸乙酰肝素样品中的污染性肝素的低水平（甚至高达<15％）非常难以通过1 H NMR（Keire等人）进行确认或定量。，2010），并且使用二维核磁共振技术更容易评估（Guerrini等人，2005）。
可以对主要包含一个GAG（> 90％）的样品进行半定量纯度评估。在D 2 O中使用已知浓度的t-BuOH和特定GAG的纯样品可以产生标准曲线。将GAG精确称取至〜10,5,2和0.5mg等分试样，并用正好1.0ml的用于NMR分析的标准溶液制成。使用综合区域; GAG的乙酸酯峰除以相对于溶液中已知的GAG量的曲线的比率产生直线关系（图4）。因此，与参考材料相比，可以评估在相同浓度和体积的溶液中制备的未知纯度的样品的纯度。这种标准曲线在评估盐和水浓度的可能贡献方面特别有用，该浓度对于该NMR分析是有效的不可见的，在小样品（<5mg）上以非破坏性方式测量不是微不足道的。

图4.标准曲线绘制了乙酸盐和内部标准共振的比例（来自^{1的NMR的积分面积）与已知质量的HS（> 95％w/w）样品（标准溶液，0.20mg/ml）}

笔记

作为干燥冻干固体或稀释溶液（D 2 O 5，5℃），GAG无限期（> 5年）是稳定的。在室温（RT）或冷冻条件（至-70℃）下，干固体似乎不会随时间降解。
完成D 2 O交换过程对NMR光谱只有微妙的影响，因此对于常规分析或在纯化监测期间，通常省略此步骤。
浓缩样品（> 60mg/ml）（例如用于13℃或快速二维核磁共振技术制备）显示出¹中的显着的线展宽和化学位移变化1 H NMR光谱，因此参考文献1必须将1H NMR记录为稀释溶液
我们已经在实验室证明，新鲜冻干的HS在静置时会吸附13％w/w的水。这是通过冻干固定和容易逆转的方法的可重复的质量增益。样品通常储存在-70°C，因此在暴露于大气中之前允许在气密容器中温热至室温，以尽量减少处理过程中的吸水量。
盐的存在可以通过GAG的物理外观来主观地注意。肝素和HS是蓬松的白色"棉毛"固体。盐的存在〜 10％w/w产生更硬，坚韧的灰白色固体，其与脱盐材料相比以更快的速度吸附大气水。对于随后进入剂量反应生物测定的少量HS进行称重尤为重要。
肝素是从生产肝素从猪粘膜中产生的侧流回收的GAG的复杂混合物。描述为肝素类的材料组成变化很大（参见图3i和3ii），取决于肝素过程的哪些侧流组合。因此，蛋白质，单个GAG（包括肝素），盐和其他生物材料的水平可以在单独来源的材料和离散批次中变化很大。纯化HS的一种方法（Shworak，2001）是在二乙基氨基乙基琼脂糖（DEAE-Sepharose）柱上分配。柱洗脱可以通过离子强度（例如，磷酸盐缓冲液中的氯化钠）逐步增加来实现。对于通过NMR分析进行分析，将其脱盐（透析），冷冻干燥，得到的无定形白色固体与D 2 O 2交换，然后记录（未发表的工作）。 />

致谢

这项研究部分得到了新西兰商业，创新和就业部以及新西兰创新网络（KiwiNet，VL001298）的支持。 Simon M. Cool博士，Victor Nurcombe博士和R. Alex A. Smith博士（新加坡免疫科学与技术研究所医学生物研究所）的合作研究得到了认可。

参考文献

Carnachan，SM，Bell，TJ，Sims，IM，Smith，RA，Nurcombe，V.，Cool，SM and Hinkley，SF（2016）。确定肝素裂解酶治疗后硫酸乙酰肝素解聚的程度。 Carbohydr Polym 152：592-597 。
Carnachan，SC和Hinkley，SFR（2017）。硫酸肝素鉴定和表征方法二酶解解和SAX-HPLC分析以确定二糖组成。生物样品7（07）：e2197。
Guerrini，M.，Beccati，D.，Shriver，Z.，Naggi，A.，Viswanathan，K.，Bisio，A.，Capila，I.，Lansing，JC，Guglieri，S.，Fraser，B.，Al -Hakim，A.，Gunay，NS，Zhang，Z.，Robinson，L.，Buhse，L.，Nasr，M.，Woodcock，J.，Langer，R.，Venkataraman，G.，Linhardt，RJ，Casu ，B.，Torri，G.和Sasisekharan，R。（2008）。硫酸化硫酸软骨素是与不良临床事件相关的肝素中的污染物。 Nat Biotechnol 26（6）：669-675。
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Keire，DA，Mans，DJ，Ye，H.，Kolinski，RE和Buhse，LF（2010）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm.nih。通过1 H NMR，SAX-HPLC和抗凝时间方法测定肝素中可能的经济动力的添加剂或天然杂质水平。"药物生物学分析" em> 52（5）：656-664。
Liu，H.，Zhang，Z.和Linhardt，RJ（2009）。从肝素污染中获得的经验教训。Nat Prod Rep 26（3）：313-321。
Shworak，NW（2001）。 In：Iozzo，RV（Ed。）。蛋白多糖协议。分子生物学方法 pp：79-89。