材料和试剂

面罩，手套和干净的实验室外套
安全眼镜
高压灭菌砂纸（中片 - 100）
高压灭菌的干酪布
高压灭菌A4纸
高压灭菌移液器技巧
0.1-10μl（Eppendorf，目录号：022491300）
2-200μl（Eppendorf，目录号：022491334）
50-1,000μl（Eppendorf，目录号：022491351）
DNA级别为15毫升的管子
Amicon ^{®超级离心过滤器（3K孔径）（EMD Millipore，目录号：UFC900308）}
Poly-Prep ^{®色谱柱（Bio-Rad Laboratories，目录号：7311550）}
50ml管
石蜡膜
胍盐酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：177253或G4505）
注意：产品"177253"已经停产。
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S8282）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：RES20908-A7）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E9884）
高压灭菌的MilliQ水
不含蛋白酶的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche Diagnostics，目录号：05056489001）
尿素（Sigma-Aldrich，目录号：U5378）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
乙酸钠（CH 3 COONa）（Sigma-Aldrich，目录号：S2889）
Maxatase（Biocon Laboratories，SãoPaulo，Brazil）
三氯乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：T6399）
甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
标准硫酸软骨素（从鲨鱼软骨提取）（Sigma-Aldrich，目录号：C4384）
标准硫酸皮肤素（Sigma-Aldrich，目录号：1171455）
标准硫酸乙酰肝素（从牛肾提取）（Sigma-Aldrich，目录号：H7640）
标准透明质酸（从人脐带提取）（Sigma-Aldrich，目录号：H1751）
注意：本产品已停产。
低密度琼脂糖（Bio-Rad Laboratories，目录号：1620100）
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）（Sigma-Aldrich，目录号：252859）
吐温20（Bio-Rad Laboratories，目录号：1706531）
EDTA III（Sigma-Aldrich，目录号：EDFS）
叠氮化钠（Merck，目录号：106688）
牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A9418）
次氯酸钠溶液（见配方）
Maxatase解决方案（见配方）
阻塞缓冲区（见配方）

设备

移液器
0.5-10μl（Eppendorf，目录号：4920000024）
2-20μl（Eppendorf，目录号：4920000040）
20-200μl（Eppendorf，目录号：4920000067）
100-1,000μl（Eppendorf，目录号：4920000083）
高压灭菌器
钻（DRAPER TOOLS，目录号：79340）
注意事项：使用无菌安装的磨石（圆柱形和大锥形骨头，树和大锥形牙齿）（浸入次氯酸钠溶液15分钟，干燥并高压灭菌）。
管旋转器
SpeedVac集中器（例如，Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：Savant ^{TM SC210 P1 SpeedVac ^TM ，目录号：SC210P1-115）}
水浴
通风柜
制冰机
微量离心机能够达到16,000 x g
离心机，能够达到2,000 x g
涡街搅拌机
实验室烤箱
Quick Scan 2000密度计（Helena Laboratories，型号：QuickScan 2000）
Elisa ELX 800 Wallac Victor2 1420 Multilabel计数器（PerkinElmer，型号：Elisa ELX 800 Wallac Victor2 1420）
磁力搅拌器

软件

基于Windows的Quick Scan 2000软件（Helena Laboratories）

程序

骨和牙齿准备
注意：调查人员必须佩戴面罩，手套和干净的实验室外套，以确保不会污染样品。这些必须在样本之间更改。必须如下所述对样品和每个样品使用的新的（经过清洁和消毒的）工具进行清洁。现代（控制）样本应在与考古样本不同的一天的不同位置处理。
1. 用次氯酸钠溶液清洗台面（按照食谱中所述进行准备）
2. 使用无菌水清洁考古学骨骼和牙齿，然后用高压灭菌的干酪布去除污垢
3. 允许风干（在台面上）。
4. 使用高压灭菌砂纸清洁骨骼样本（但不是牙齿）。
  注意：由于牙釉质形成了坚硬，光滑的表面，砂纸对其没有太大的影响，并且可以通过使用高压灭菌的干酪布来除去污垢颗粒。
5. 用次氯酸钠溶液用高压灭菌的干酪布擦拭骨骼和牙齿，确保样品暴露于次氯酸钠15分钟以进行灭菌。
6. 允许风干（在台面上）。
7. 将骨头和牙齿样品置于高压灭菌的A4纸上
8. 佩戴安全眼镜，使用钻孔钻头和无菌安装的磨石（预先浸入次氯酸钠溶液15分钟，干燥并高压灭菌）钻骨头和牙齿样品，直到在DNA级别15中收集必要数量的骨或牙粉（25-100毫克骨或牙粉/管）。
9. 将骨粉和牙粉放在-20°C直到进一步加工。
  注意：约25mg的骨或牙粉将稍后提供一个PG或GAG样品进行琼脂糖凝胶电泳。
蛋白多糖提取
注意：调查人员必须佩戴面罩，手套和干净的实验室外套，以确保不会污染样品。现代（控制）样本应在与考古样本不同的一天的不同位置处理。
1. 将25-100mg上述制备的骨或牙粉悬浮于4.5ml 4M胍-HCl，20mM NaH 2 PO 4，30mM Na 2含有完全蛋白酶抑制剂混合物的200mM HPO 4，300mM EDTA，pH 7.4。
  注意：根据制造商的建议，用MilliQ水制备悬浮骨或牙粉的溶液，并含有一片加入到50ml溶液中的完全蛋白酶抑制剂混合物。
2. 在4℃恒定旋转24小时以保持溶液移动，并防止骨骼或牙齿粉末沉淀（例如在冷室中的管旋转器上）。
3. 加入9ml含有完全蛋白酶抑制剂混合物的7M尿素，0.3M NaCl，0.05M CH 3 COONa，pH6.5的溶液。
  注意：根据制造商的建议，将溶液用MilliQ水制备，并将一片cOmplete蛋白酶抑制剂混合物加入到50ml溶液中。
4. 在4℃下保持恒定旋转另外24小时以保持溶液移动并防止骨骼或牙齿粉末沉积（例如，在冷室中的管旋转器上）。 />
5. 通过Poly-Prep 色谱柱过滤溶液，以在4℃（例如，在冷室中）除去细颗粒。
6. 使用Amicon Supreme 15离心过滤器，在4℃下将溶液浓缩并脱盐至约500μl。
7. 加入完全蛋白酶抑制剂混合物（从储备溶液25x浓度，根据制造商的建议制备），并在离心蒸发器中真空干燥（冷冻干燥）。
8. 将粗蛋白质/蛋白多糖提取物储存在-20°C直到进一步处理注意：25mg骨或牙粉提供约5μg的PG。
糖胺聚糖提取
注意：调查人员必须佩戴面罩，手套和干净的实验室外套，以确保不会污染样品。现代（控制）样本应在与考古样本不同的一天的不同位置处理。
1. 将25-50mg上述制备的骨或牙齿粉末悬浮于1ml最大值溶液（按照食谱中所述制备）。
2. 将样品在60°C的水浴中孵育2天
3. 加入0.1体积的三氯乙酸（TCA），涡旋并将样品保持在冰上15分钟注意：TCA应在通风橱中使用玻璃移液器加入，以避免吸入蒸气。当处理TCA避免皮肤接触时，佩戴安全眼镜以保护眼睛并佩戴手套，最好是丁腈手套。始终将TCA添加到样品中，而不是相反。
4. 在4℃离心样品（15分钟，2,250×g，4℃），收集上清液（放在冰上）。
5. 慢慢地逐滴加入2个体积的甲醇，同时涡旋注意：必须以不间断的方式，以恒定的涡流加入完整体积的甲醇。
6. 允许样品在-20℃下放置过夜，使GAG沉淀注意：在运送到冰箱或从冰箱运送时，请务必小心处理样品（在冰上运输，没有轻快的运动）。
7. 在4℃离心样品（10分钟，2,250×g /次）。
8. 通过移液去除上清液，并在室温（直到干燥）或实验室烘箱（50℃，约1小时）内干燥沉淀。
  注意：从管中取下盖子，用Parafilm盖住开口。打破石蜡膜，让甲醇蒸发。
9. 将粗糖胺聚糖提取物储存在-20°C直至进一步处理注意：25mg骨或牙粉提供约5μgGAG。
PG和GAG分析
1. 通过Dietrich和Dietrich（1976）所述的琼脂糖凝胶电泳对PGs和GAGs（硫酸软骨素，硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素）进行分析和定量，在MilliQ中悬浮（1μg/μl）粗蛋白/ PG提取物和GAG提取物具有或不具有完全蛋白酶抑制剂混合物的水（从储备溶液25x浓度，根据制造商的建议制备），并将5μl应用于琼脂糖凝胶。
2. 用于如Martins等人所述定量透明质酸（HA）。（2003）中，将300μg封闭缓冲液（如食谱中所述制备）中的20μgGAG提取物悬浮，一式三份进行测定。

数据分析

如Dietrich和Dietrich（1976）所述，如果通过琼脂糖凝胶电泳分析和定量GAG，则使用Quick Scan 2000密度计和软件程序（Helena Laboratories）按照供应商的说明扫描和定量干燥的染色的琼脂糖凝胶。将出现在凝胶上的样品GAG带的强度与由应用于相同凝胶的已知浓度（全部1mg / ml）的这些GAG的混合物的硫酸软骨素，硫酸皮肤素和硫酸乙酰肝素的标准条带进行比较。然后计算100mg骨粉或牙粉的GAG总量，然后除以100mg骨或牙粉提取的蛋白质总量，以提供μg/ mg蛋白质中的GAG量。
如果根据Martins等人描述的基于探针的夹心ELISA测定来定量HA。（2003）中，然后使用Elisa ELX 800 Wallac Victor2 1420多标记计数器（PerkinElmer）读取板，并且通过与添加到板中的标准HA进行比较来计算HA的量以产生浓度曲线（0,0.48,1.95， 7.8,31.2,125,500和1,000ng / ml HA）。然后根据mg蛋白质计算HA，以提供ng / mg蛋白质的量。

食谱

次氯酸钠溶液（终浓度为1.25％）
稀释实验室漂白剂（次氯酸钠）1:10在高压灭菌的MilliQ水中在30天内使用
在含有1M NaCl的0.05M Tris-HCl缓冲液[用MilliQ水制备，pH8.0）中的最大值溶液（[4mg / ml]）
最终体积为100ml：

称量400毫克maxatase和5.84毫克的NaCl
将maxatase和NaCl加入到0.05M Tris-HCl缓冲液（pH8.0）中，并使用磁力搅拌器
进行混合
倒入两个50ml管中，并以最大速度从30分钟离心至1小时
将上清液转移到15 ml管中，弃去白色沉淀物
储存于-20°C

阻塞缓冲液（pH 7.75）
0.05M Tris-HCl
0.15 M NaCl
0.05％吐温20
0.02 mM EDTA III
7.7mM叠氮化钠
1％牛血清白蛋白

致谢

该协议来自Coulson-Thomas等人，2015年。这项工作得到CAPES（协调员协会），CNPq（Conselho Nacional de DesenvolvimentoCientíficoeTecnológico）和FAPESP（保加利亚圣保罗圣保罗圣保罗圣保罗教堂）。这项工作中使用的考古学骨骼和牙齿由林肯大学，英国林肯大学提供。

参考文献

Coulson-Thomas，YM，Coulson-Thomas，VJ，Norton，AL，Gesteira，TF，Cavalheiro，RP，Meneghetti，MC，Martins，JR，Dixon，RA和Nader，HB（2015）。考古学人体骨骼和牙齿中蛋白多糖和糖胺聚糖的鉴定。 PLoS One 10（6）：e0131105。
Dietrich，CP和Dietrich，SM（1976）。电泳酸性粘多糖在二胺缓冲液中的作用。 Anal Biochem 70（2）：645-647。
Martins，JR，Passerotti，CC，Maciel，RM，Sampaio，LO，Dietrich，CP and Nader，HB（2003）。＆nbsp; 通过对正常和肝硬化患者血清的新的基于非竞争性荧光的测定法实际测定透明质酸。 319 1）：65-72。
Nader，HB，Chavante，SF，dos-Santos，EA，Oliveira，TW，de-Paiva，JF，Jeronimo，SM，Medeiros，GF，de-Abreu，LR，Leite，EL，de-Sousa-Filho，JF， Castro，RA，Toma，L.，Tersariol，IL，Porcionatto，MA和Dietrich，CP（1999）。