材料和试剂

9厘米直径的培养皿
外科刀片（Swann Morton手术刀片20号）
1.7ml和2ml Eppendorf管
透析管（Sigma-Aldrich，目录号：D9777）
50ml Falcon管
Whatman＃1滤纸（GE Healthcare，目录号：1001-125）
移液器提示
拟南芥种子
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
30％丙烯酰胺/Bis溶液（Solarbio，目录号：A1010）
TEMED（Sigma-Aldrich，目录号：T22500）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A1296）
牛血清白蛋白（BSA）*
95％乙醇*
过硫酸铵（NH 4）2 S 2 O 8 *
次氯酸钠溶液（NaClO）*
氢氧化钠（NaOH）*
醋酸钠（NaAc）*
磷酸（H 3 3 PO 4）*
盐酸（HCl）*
硝酸铵（NH 4 NO 3）*
硝酸钾（KNO 3 ）*
氯化钙（CaCl 2）*
硫酸镁（MgSO 4）*
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）*
硫酸钾（K 2 O 4 SO 4）*
碘化钾（KI）*
正硼酸（H 3 3 BO 3）*
硫酸锰（MnSO 4）*
硫酸锌（ZnSO 4）*
钼酸钠（Na 2 MoO 4）*
氯化钴（II）（CoCl 2）*
硫酸铜（CuSO 4 ）*
Fe-EDTA *
Myo肌醇*
烟酸*
盐酸吡哆醇*
硫胺素HCl *
大豆*
蔗糖*
溴酚蓝*
考马斯亮蓝G-250 *
MES（AMRESCO，目录号：E169）
β-萘酸磷酸酯（Sigma-Aldrich，目录号：N7375）
Fast Black K（Sigma-Aldrich，目录号：F7253）
pNPP（Sigma-Aldrich，目录号：P4744）
BCIP（Gold Bio，目录号：B-500-10）
Tris碱（NOVON SCIENTIFIC，目录号：ZZ02531）
DTT（Sigma-Aldrich，目录号：DTT-RO）
SDS（AMRESCO，目录号：0227）
DMSO（AMRESCO，目录号：0231）
PMSF（Sigma-Aldrich，目录号：52332）
液氮
Murashige和Skoog（MS）培养基（P +和P- MS培养基）（参见食谱，Murashige和Skoog，1962）
APase活动分析检测缓冲液，pH 4.9（参见食谱）
反应缓冲液，pH 4.9（参见食谱）
pNPP溶液（1.0mg/ml）（参见食谱）
BCIP库存解决方案（100x）（见配方）
布拉德福德解决方案（见配方）
5x蛋白质加载缓冲液（参见食谱）

注意：来自任何合格公司的类似试剂都适用于本实验。

设备

移液器
镊子（Fisher Scientific，目录号：22-327379）
分光光度计（WPA，Biowave）
250毫升锥形瓶（锥形瓶）
轨道摇床（Qilinbeier，型号：TS-1）
冷冻干燥机（北京松原华兴，型号：LGJ-10）
Microfuge（Eppendorf，型号：5415 D）
微波炉
小砂浆和杵
水浴（上海益恒，型号：DK-8D）**
分析天平（Mettler Toledo，型号：PB153-L）**
pH计（Mettler Toledo，型号：FE20）**
Mini-PROTEAN ^® Tetra Vertical Electrophoresis Cell（Bio-Rad Laboratories，型号：Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell，目录号：1658004）

注意：任何合格公司的类似设备都适合本实验。

软件

SPSS统计

程序

根系相关APase活性的量化和释放到生长培养基中的APase的活性
1. 根相关APase活性的量化
  1. 将种子用5％次氯酸钠溶液/0.1％Triton X-100悬浮，并在室温下温育10分钟，偶尔倒置进行表面灭菌。
  2. 取出液体，用灭菌的ddH 2 O洗涤种子4次
  3. 将含有全强度或半强度Murashige和Skoog（MS）培养基的每个9cm直径的培养皿的上部水平放置20-30个表面灭菌的拟南芥种子（P +或P-中）。对于每个生物样本，使用三个重复
  4. 保持培养皿在4°C 2天分层
  5. 将培养皿垂直放置在受控的环境生长室中，并允许幼苗在16小时光/8小时黑暗方案（90μmol光子 sec < sup> -1 ）在22-23℃
  6. 用剃须刀切割根并测量根长度。在P +培养基上生长的拟南芥幼苗的平均根长度为4.0-5.5厘米，在P-培养基上生长的幼苗的长度为2.5-4.0厘米。
  7. 将两根镊子浸入650微升预热（37℃）的1.7ml Eppendorf管中的反应缓冲液中。
  8. 快速加入50μlpNPP溶液。
  9. 在37°C孵育1-4小时。
  10. 加入100μl0.4 N NaOH，用手摇动停止反应。
  11. 用镊子去除根部，并用分光光度计测量剩余溶液中410 nm处的吸光度（A <410>）。
  12. 计算与根相关的APase活动为A 410//root/h（图1A）。
    
    图1.由拟南芥（WT）和各种单，双和三重（或）紫色磷酸酶分泌的APase活性的分析）突变体在P +或P-培养基中或培养基中生长。使用pNPP作为底物测定培养基（B）中的根相关APase活性（A）和APase活性。价值观是SE的手段。对整个数据集进行单因素方差分析，使用SPSS Tukey HSD检验进行比较，比较 0.05。在四个地块的每一个中，具有不同字母的值显着不同。改编自Wang等人。（2014）。
2. 将蛋白质浓缩在液体生长培养基中
  1. 转移大约150只9日龄的幼苗，在P +固体培养基上用高压灭菌镊子垂直生长至含有100ml P +或P-液体培养基的250ml高压灭菌锥形瓶中。
  2. 将烧瓶放置在轨道振荡器（40rpm/min）上，并允许幼苗在16小时光/8小时黑暗方案（90μmol光子）下生长6-7天。 sec ^-1）在22-23°C
  3. 从烧瓶中取出所有幼苗，并将液体介质冷冻至-20°C
  4. 将介质放在预冷冻式冷冻干燥机的支架上，盖上盖子，并将介质冻干3-4天。
  5. 使用5-6ml的ddH 2 O彻底清洗烧瓶的底部，并将洗涤液转移到透析管上。
  6. 在4℃下对样品进行24小时透析4升预冷ddH 2 O，每6小时更换ddH 2 O。
  7. 将透析的样品转移到2 ml管中，并以1,500 x g离心5分钟。
  8. 将上清液转移到50ml Falcon管中，并将液体冷冻至-20℃，然后如步骤A2d所述将其冻干2天。
  9. 将冻干的样品溶解于200μl的ddH 2 O。
  10. 使用如步骤A3所述的Bradford方法测量蛋白质浓度。
  11. 浓缩的分泌蛋白质可以立即使用，也可以储存在-80℃进行进一步分析。
3. 蛋白质浓度的测定
  1. 移取0,2,4,8,12,16或20μl1μg/μlBSA至1.7ml Eppendorf管中，加入ddH 2 O至终体积为20μl。 >
  2. 向每个管中加入980μlBradford溶液，并充分混匀
  3. 在室温下孵育5分钟。
  4. 用分光光度计测量595nm处的吸光度（A 595 ）
  5. 通过绘制BSA内容和A 595 制作Bradford标准曲线。
  6. 向980μlBradford溶液中加入20μl浓缩分泌的蛋白质。
  7. 混匀，室温孵育5分钟
  8. 用分光光度计测量A 595。
  9. 将得到的A 595值与Bradford标准曲线进行比较，以确定各种样品的蛋白质浓度。
4. 生长培养基中APase活性的定量
  1. 将从液体生长培养基中收集的10μl浓缩的蛋白质（约2.5μg）加入到在1.7ml Eppendorf管中的590μl反应缓冲液中。对于每个样品，至少进行三次重复。
  2. 向反应混合物中加入80μl的pNPP溶液
  3. 在37℃孵育1小时。
  4. 加入120μl0.4 N NaOH终止反应。
  5. 用分光光度计测量A <410>
  6. 计算生长培养基中的APase活性为Aβ410/mg蛋白/分钟（图1B）。
使用组织化学染色分析根相关APase活性
1. 在P +或P- MS培养基上垂直栽培幼苗6-7天，如步骤A1a-A1e所述。
2. 向250ml锥形瓶中加入100ml ddH 2 O和0.5g琼脂，轻轻摇动烧瓶，然后在微波炉中加热烧瓶直到琼脂完全溶解。
3. 加入1ml BCIP储备液（100x），用手短暂摇匀。
4. 将BCIP /琼脂溶液保持在室温或使用流动的水将溶液冷却几分钟至约40℃。
5. 将BCIP /琼脂溶液保存在40°C水浴中
6. 在一排拟南芥根部上均匀地覆盖约5ml BCIP /琼脂溶液，并在室温下孵育约24小时（图2）。
  
  图2.关于如何将BCIP /琼脂溶液覆盖在培养皿上生长的拟南芥幼苗的根表面的示范
7. 在P-培养基上生长的拟南芥的根将被染成蓝色，而在P +培养基上生长的这些根将保持未染色（图3）。
  
  图3.根相关APase活性的组织化学染色上排：在没有BCIP染色的MS P +和P-培养基上生长的7天龄拟南幼苗的形态。底行：其根用0.01％BCIP/0.5％琼脂溶液染色24小时的幼苗。在下排中，在P培养基（右下方）生长但不在P +培养基上生长的幼苗（左下）的幼苗的根上检测到根相关的APase活性（如蓝色所示）。
8. APase组织化学染色受BCIP浓度的影响很大。高浓度的BCIP（0.08％-0.16％）可引起过度染色，这可能掩盖分泌的APase活性水平的差异（图4）。
  
  图4.不同浓度的BCIP对在MS-P培养基上生长的7天龄拟南芥幼苗的根相关APase活性的染色的影响使用的BCIP在左下角显示。 nop1-1 和 nop1-2 是在AtPAP10基因中具有突变的拟南芥突变体。随着BCIP浓度的增加，其他根系相关APase（主要是AtPAP12和AtPAP26）的活性也被检测到。改编自Wang等人。（2011）。

分析释放到生长培养基中的APase同种型（凝胶测定）
通过在SDS-PAGE（变性凝胶）或Native-PAGE（非变性凝胶）上分离蛋白质样品，观察释放到生长培养基中的APase的同功酶谱，然后用显色底物β-NAP和快速黑色K对于Native-PAGE分析，从凝胶和运行缓冲液中省去SDS 根据下表1制备10％分离凝胶和5％堆积凝胶（SDS-PAGE）
表1.用于分离凝胶和堆叠凝胶的配方

库存解决方案	<5>堆积凝胶（5 ml）	10％分离凝胶（10 ml）
30％丙烯酰胺/双溶液	0.83 ml	3.3 ml
1.5M Tris-HCl，pH8.8	-	2.5 ml
1M Tris-HCl，pH6.8。	0.63 ml	-
10％SDS	0.05 ml	0.1 ml
10％（NH 4）2 2 2	0.05 ml	0.1 ml
TEMED	0.005 ml	0.004 ml
ddH ₂ O	3.40 ml	4.0 ml

根据Bio-Rad说明设置SDS-PAGE凝胶运行系统（ http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6040.pdf ）。
加入1x预冷却至4℃的蛋白质运行缓冲液
彻底混合2.5μg分泌蛋白与1/5体积的5x蛋白加载缓冲液，并将样品载于SDS-PAGE凝胶上。
注意：不要加热样品。
在60V下分离蛋白质30分钟，然后120V，150分钟（均为4℃）
小心地将凝胶转移到容器中的预冷却（4℃）ddH 2 O，并轻轻摇动10分钟以从凝胶中除去SDS。
更换预冷（4℃）ddH 2 O并重复4次。
加入50ml反应缓冲液，并在4℃下轻轻摇动15分钟。
更换反应缓冲液并重复4次
加入50毫升APase活性分析检测缓冲液，并在37℃下温和搅拌孵育1-3小时。 APase的同功酶谱可视化为凝胶上的红棕色带（图5）

图5.生长培养基中APase活性的谱。通过SDS-PAGE（A）或天然PAGE（B）分离2.5μg量的分泌蛋白，并用0.3mg/ml β-NAP和0.5mg/ml Fast Black K.蛋白质分子标记位于（A）中凝胶的左侧。每个面板右侧的数字表示不同的APase同种型。改编自Wang等人。（2014）。

笔记

BCIP /琼脂溶液的温度对于检测根相关的APase活性很重要。如果溶液太热（高于60°C），则会损害拟南芥根系，并使根表面上的APase失活。
去除SDS对于获得APase同功酶的清晰概况至关重要。

食谱

Murashige和Skoog（MS）培养基（P +和P- MS培养基）
P + MS培养基是全强度MS培养基（Murashige and Skoog，1962）。全强度MS培养基的配方如下所示。对于P-MS培养基，将P + MS培养基中的1.25mM KH 2 PO 4 N 4替换为1.25mM K 2 SO 4 。在121℃高压灭菌P +和P-培养基10分钟，并将培养基储存在室温下

NH 4< 3>< 3>	20.62 mM	CuSO 4	0.1μM
KNO ₃	18.79 mM	Fe-EDTA	100μM
CaCl 2	2.99 mM	Myo肌醇	0.55μM
MgSO 4	1.5 mM	烟酸	4.1μM
KH ₂ PO ₄	1.25 mM	吡哆醇盐酸盐	2.4μM
K> SO SO SO SO>	0.625 mM	盐酸硫胺素	0.3μM
KI	5μM	大豆	30μM
3 <3> 3	100μM
MnSO 4	92.5μM	蔗糖	10克/升
ZnSO 4	30μM	MES	5.1 g/L
NaMoO 4	1μM	pH	5.8
CoCl ₂	0.1μM	琼脂	10克/升

APase活性分析检测缓冲液，pH 4.9（新鲜制备）
0.3mg/mlβ-萘酸磷酸盐
0.5 mg/ml Fast Black K
10mM MgCl 2
50 mM NaAc
反应缓冲液，pH 4.9
10mM MgCl 2
50 mM NaAc
储存于4°C
pNPP溶液（1.0mg/ml）
将10mg量的pNPP溶解在10ml的反应缓冲液
中在-20°C储存等分试样
BCIP库存解决方案（100x）
BCIP储液的浓度为10g/L，工作液的浓度为0.1g/L 准备BCIP库存解决方案：

将0.1g BCIP粉末溶于8ml ddH 2 O中，然后加入约14滴1N NaOH直至BCIP功率完全溶解。
加入ddH 2 O至总体积为10ml，然后过滤溶液以除去未溶解的BCIP颗粒
在-20°C储存等分试样

布拉德福德解决方案
将100毫克考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95％乙醇中加入100ml 85％H 3 PO 4，然后加入ddH 2 O至1,000ml
通过Whatman＃1滤纸，并将滤液在4℃下储存在棕色瓶中
5x蛋白加载缓冲液
250mM Tris-HCl，pH6.8
10 mM DTT
10％SDS
30％（v/v）甘油 0.05％（w/v）溴酚蓝
将缓冲液储存在室温下

致谢

这项工作得到了中国国家自然科学基金（授权号31370290和30670170）的支持。

参考文献

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Murashige，T和Skoog，F.（1962）。用于烟草组织培养物的快速生长和生物测定的修订培养基。生物学植物化学 15（3）：473-497。
Tomscha，JL，Trull，MC，Deikman，J.，Lynch，JP和Guiltinan，MJ（2004）。< a class ="ke-insertfile"href ="https：//www.ncbi.nlm.nih。磷酸酶生物碱突变体具有改变的磷关系。植物生理学135（1）：334-345。
Tran，HT，Hurley，BA和Plaxton，WC（2010）。
Trull，MC和Deikman，J.（1998）。一个拟南芥突变体缺失一个酸性磷酸酶同种型。植物 206（4）：544-550。

Vicki，K.和William，P。（2013）。蛋白质提取，酸性磷酸酶活性测定和可溶性蛋白质浓度的测定。生物方案 e889。

王丽丽，李，，，钱，吴国强，高尧，黄，，王，，朱，，吴，，Wang and and Liu ，D.（2011）。拟南芥紫色磷酸酶AtPAP10主要与根表面相关，并且在磷酸盐限制的植物耐受性中起重要作用。植物生理学157（3）：1283-1299。

Wang，L.，Lu，S.，Zhang，Y.，Li，Z.，Du，X. and Liu，D。（2014）。拟南芥紫色酸性磷酸酶的比较遗传分析AtPAP10，AtPAP12和AtPAP26为其在植物中的作用提供了新的见解适应磷酸盐剥夺。 J Integr Plant Biol 56（3）：299-314。