材料和试剂

过量生产和提取细菌蛋白激酶
1. 50ml锥形管（Greiner Bio One International，目录号：227261）
2. 无菌培养管（SARSTEDT，目录号：62.515.006）
3. 灭菌过滤器（0.22μm）（Dutscher Scientific，目录号：51732）
4. 分光光度计比色皿（Dutscher Scientific，目录号：030101）
5. 大肠杆菌BL21（pREP4-groESL）（Amrein等人，1995）
6. pGEX-6P-3（Smith和Johnson，1988）/pGEX-蛋白激酶
7. 预冷dH 2 O
8. 蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich，目录号：P8340）
9. LB培养基（Lennox）（Carl Roth，目录号：X964）
10. 氨苄青霉素（Carl Roth，目录号：K029）
11. 卡那霉素（Sigma-Aldrich，目录号：K4000）
12. 异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）（Carl Roth，目录号：2316）
13. 氯化钠（NaCl）（Carl Roth，目录号：3957）
14. 氯化钾（KCl）
15. 磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）
16. 磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）
17. LB培养基+氨苄西林+卡那霉素
  1. LB培养基（参见食谱）
  2. 100μg/ml氨苄青霉素（参见食谱）
  3. 25μg/ml卡那霉素（见配方）
18. 0.1 M IPTG（见配方）
19. 1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
细菌蛋白激酶的纯化
1. 微管
  1.5毫升（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
  2毫升（SARSTEDT，目录号：72.694.006）
2. 聚丙烯柱1ml（QIAGEN，目录号：34924）
3. Spectra/Por 透析膜MWCO：3.5-5kD（Biotech CE试剂盒）（Spectrum，目录号：131201T），在4℃在潮湿气氛中储存
4. Protino谷胱甘肽琼脂糖-4B（Macherey-Nagel，目录号：745500.10），储存在4℃下
5. 甘油（Carl Roth，目录号：3783）
6. 三羟甲基氨基甲烷（Tris）（Carl Roth，目录号：5429）
7. 谷胱甘肽（Sigma-Aldrich，目录号：G4251）
8. 氯化钠（NaCl）（Carl Roth，目录号：3957）
9. 1x PBS（见食谱）
10. GST洗脱缓冲液（参见食谱）
11. 透析缓冲液（见配方）
净化ARP2/3复合体
1. 聚丙烯柱1ml（QIAGEN，目录号：34924）
2. PD-10色谱柱（GE Healthcare，目录号：17085101）
3. 由Acanthamoeba castellanii制备的肌动蛋白耗尽的细胞裂解物（Zuchero，2007）
4. 液氮（液氮N 2）
5. Tris（Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
6. 氯化镁（MgCl 2）（Fisher Scientific，目录号：BP214-500）
7. 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（Fisher Scientific，目录号：BP2939100）
8. 二硫苏糖醇（DTT）（Fisher Scientific，目录号：BP172-5）
9. 甘油（Fisher Scientific，目录号：P2294）
10. 氯化钾（KCl）（Fisher Scientific，目录号：P217-500）
11. 三磷酸腺苷（ATP）（Fisher Scientific，目录号：BP413-25）
12. N-WASP VCA偶联CH-Sepharose（Zuchero，2007）
13. 苯基琼脂糖凝胶（Sigma-Aldrich，目录号：P2459）
14. 缓冲液A（参见食谱）
15. ARP2/3洗脱缓冲液（参见食谱）
16. ARP2/3存储缓冲区（见配方）
ARP2/3复合物的脱磷酸酯
1. 微管（1.5 ml）
2. 3,500 MWCO迷你透析装置（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：69550）
3. 2mM Tris，pH 8.0（Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
4. 南极磷酸酶（New England Biolabs，目录号：M0289）
5. N-WASP VCA偶联Sepharose（Zuchero，2007）
6. Tris（Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
7. dH ₂ O
8. 氯化镁六水合物（MgCl 2）（Fisher Scientific，目录号：BP214-500）
9. 氯化锌（ZnCl 2）（Sigma Aldrich，目录号：Z3500）*
10. 5x HipH缓冲液（见配方）
11. 缓冲液A（参见食谱）
12. ARP2/3洗脱缓冲液（参见食谱）
磷酸化测定
1. 微管（1.5ml）（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
2. 纯化细菌激酶及其催化变体
3. 纯化和纯化/脱磷酸化的ARP2/3复合物
4. Tris（Carl Roth，目录号：5429）
5. 氯化锰（MnCl 2）（Fisher Scientific，目录号：M87-100）
6. DTT（Carl Roth，目录号：6908）
7. ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A5394）*
8. dH ₂ O
9. 氯化镁六水合物（MgCl 2）（Carl Roth，目录号：2189）
10. 氯化锌（ZnCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：211273）
11. 十二烷基硫酸钠（SDS）（Carl Roth，目录号：2326）
12. 甘油（Carl Roth，目录号：3783）
13. 溴苯酚蓝（Sigma-Aldrich，目录号：B6131）*
14. β-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：O34461-100）
15. 南极磷酸酶（New England Biolabs，目录号：M0289）
16. 10x磷酸化缓冲液（参见食谱）
17. ATP溶液为0.5mg.ml ^-1（参见食谱）
18. 5x Laemmli加载缓冲区（请参阅配方）
19. 5x HipH缓冲液（见配方）
用Western Blot检测磷酸化水平
1. 方格培养皿（Greiner Bio One International，目录号：688162）
2. Whatman 3 MM CHR纸（GE Healthcare，目录号：3030-917）
3. 硝酸纤维素膜Optitran BA-S85增强型NC（GE Healthcare，目录号：10439194）
4. 50ml圆锥管
5. 石蜡膜
6. 塑料包装
7. 页面标尺^TM预饱和蛋白梯（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：26616）}
8. 单克隆小鼠抗磷酸苏氨酸抗体，克隆PTR-8（Sigma-Aldrich，目录号：P6623）
9. 山羊抗小鼠IgG过氧化物酶抗体（Sigma-Aldrich，目录号：A0168）
10. 超信号西微微化学发光底物（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：34080）}
11. Rotiphorese凝胶30（30％丙烯酰胺，0.8％双丙烯酰胺）（Carl Roth，目录号：3029）
12. Tris（Carl Roth，目录号：5429）
13. dH ₂ O
14. SDS（Carl Roth，目录号：2326）
15. 过硫酸铵（APS）（Carl Roth，目录号：9592）
16. 四甲基乙二胺（TEMED）（Carl Roth，目录号：2367）
17. 甘氨酸（Carl Roth，目录号：0079）
18. 冰醋酸
19. 乙醇
20. 考马斯亮蓝R-250（MP Biomedicals，目录号：1-800-854-0530或MP Biomedicals，目录号：02190682）
21. 甲醇
22. 6-氨基己酸
23. 氯化钠（NaCl）（Carl Roth，目录号：3957）
24. 牛血清白蛋白（BSA）（Carl Roth，目录号：T844）
25. 吐温20（VWR，BDH ^{®，目录号：663684B）}
26. 抗磷酸酪氨酸抗体（EMD Millipore，目录号：AB1607）
27. 迁移缓冲区（见配方）
28. 12％SDS-PAGE凝胶（见配方）
29. 染色溶液（参见食谱）
30. 解决方案（见配方）
31. 组装半干运输
  一个。转移解决方案1（见配方）
  b。转移解决方案2（见配方）
  C。转移解决方案3（见配方）
32. Tris缓冲盐水（TBS）（见食谱）
33. TBS-5％BSA（参见食谱）
34. TBS-0.1％吐温20（参见食谱）
35. 抗磷酸核糖抗体溶液（参见食谱）
36. 抗小鼠过氧化物酶抗体溶液（参见食谱）

注意：这些产品已经停产。

设备

振荡器/培养箱在37℃和20℃用于管和500ml锥形瓶
高压灭菌器
Ultrospec 10细胞密度计（GE Healthcare，Amersham Biosciences，型号：Ultrospec 10）
圆锥和微管在4°C的离心机
法国压力机（美国仪器公司）
用于锥形和微管的管旋转器
支持净化柱
NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：NanoDrop ^TM 2000）}
冰箱-80°C
实验室水浴37°C和30°C
100°C干块加热器
Hoefer ^{TM双重凝胶脚轮系统（GE Healthcare，Amersham Biosciences，型号：Dual Gel Caster）}
电泳电源
GD3000 D发生器（Sebia）的半干式吸墨纸（C.B.S Scientific，目录号：EBU-4000）
ChemiStart 5000（Fisher Bioblock Scientific）

程序

细菌蛋白激酶的生产和提取
为了测试蛋白激酶磷酸化ARP2/3复合物的能力，蛋白质必须在适当的细胞表达系统中过表达并纯化。例如，编码蛋白激酶的基因可以克隆到pGEX-6P-3质粒中以产生具有N-末端GST标签的融合蛋白（在我们的情况下可以经常使用BamHI/SalI限制性位点）。蛋白激酶的催化变体，具有消除激酶活性的氨基酸取代，应该由相同的构建体产生并用作对照。诱变可以使用QuikChange II定点诱变试剂盒（Stratagene）根据制造商的说明书来替代与甲硫氨酸进行供体-ATP结合所必需的不变赖氨酸。然后将遗传构建体转化到表达GroES和GroEL伴侣蛋白的BL21（pREP4-groESL）大肠杆菌菌株中，以促进过量产生的感兴趣的融合蛋白的折叠，这里是GST蛋白激酶注意：pGEX-6P-3质粒不总是适用于您的蛋白质的克隆和表达。在这种情况下，pQE30质粒也可用于产生6His亲和标记的蛋白激酶。然后，纯化方案应适于包括通过固定的金属亲和介质（即镍珠）的纯化。
1. 接种含有100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的5ml含有上述过量产生菌株的LB培养基。
2. 在37℃下搅拌孵育培养一夜。
3. 接种100ml的LB +氨苄青霉素+卡那霉素与2ml过夜的细菌培养物（稀释1/50）。
4. 在37℃下搅拌孵育培养物直到光密度达到0.7的OD 600nm 。
5. 在培养物中加入1ml 0.1M IPTG（终浓度为1mM）以诱导重组蛋白质的过量产生。
6. 在20°C下再搅拌孵育另外4小时。
7. 将培养物质均匀分成两个50ml的锥形管。
注意：对于所有剩余的步骤，样品应保存在冰上。
1. 将6,000 x g的两个管在4℃离心10分钟。
2. 倾倒上清液。
3. 用10ml预冷的dH 2 O洗涤每个细菌颗粒。
4. 将两个丸粒放入一个锥形管中。
5. 在4℃下以6,000×g离心10分钟。
6. 倾倒上清液。
7. 用5ml预先预先注入的1x PBS和50μl蛋白酶抑制剂混合物重悬细菌。
8. 通过法国新闻界两次传播细菌。
9. 在4℃下以14,000xg离心提取物30分钟。
10. 收集含有可溶性过量产生蛋白质的上清液
细菌蛋白激酶的纯化
1. 平衡谷胱甘肽琼脂糖-4B树脂：
2. 将含有过量产生的蛋白质的上清液加载到平衡的谷胱甘肽树脂上。
3. 蛋白质/树脂混合物在4℃下温和旋转孵育4小时
4. 将蛋白质/树脂混合物装入柱子上，并通过重力流使色谱柱排空，以将树脂从流通中分离出来。
5. 收集流过并负载到柱中第二次收集尽可能多的重组蛋白。
6. 用5ml PBS冲洗树脂。允许PBS通过重力流动通过色谱柱。重复这个洗涤步骤3次。
7. 用1ml GST洗脱缓冲液洗脱GST标记的蛋白激酶两次，并将样品保持在冰中
8. 透析膜透析洗脱液：
9. 用NanoDrop测定法确定蛋白质浓度注意：可以使用任何确定蛋白质浓度的方法。
10. 将100μl等分的蛋白质分配到1.5ml预先置入的微量离心管中
11. 加入25μl甘油（最终20％）
12. 将蛋白质储存在-80°C直到需要。
  
  图1.纯化的细菌蛋白激酶的实例使用来自嗜肺军团菌细菌GST-LegK2的过表达和纯化的细菌蛋白激酶的SDS-PAGE凝胶的考马斯染色。 MW：分子量，NI：细菌的非诱导级分，I：细菌的诱导级分，E：洗脱级分
净化ARP2/3复合物
1. 所有试剂和纯化的ARP2/3复合物都必须在4°C下进行
2. 将含有VCA偶联的琼脂糖凝胶的1ml聚丙烯柱与缓冲液A平衡
3. 在4℃下将Acanthamoeba castellanii 的肌动蛋白耗尽的提取物应用于该柱。
  注意：如前所述在Zuchero（2007）中制备的棘皮棘球绦虫肌动蛋白耗尽的提取物。 Acanthamoeba体外肌动蛋白装配测定和纯化。方法Mol Biol 370：213-226。
4. 用20个柱体积的缓冲液A洗涤
5. 用ARP2/3洗脱缓冲液洗脱ARP2/3
6. 通过在洗脱缓冲液中平衡的1ml苯基Sepharose柱，然后通过1.5柱体积的洗脱缓冲液，将ARP2/3浓缩的级分通过。
7. 收集滤液，并通过SDS-PAGE鉴定富含ARP2/3的级分
8. 使用PD10色谱柱或透析将ARP2/3复合物浓缩物转化为ARP2/3存储缓冲液。
9. 等分的ARP2/3复合物，在液体N 2中闪光冷冻并存储在-80℃。
  
  图2.纯化的ARP2/3复合物使用从Acanthamoeba castellanii纯化的ARP2/3复合物的SDS-PAGE凝胶的考马斯染色。 MW：分子量
ARP2/3复合物的脱磷酸酯
1. 用2mM Tris pH8.0稀释ARP2/3复合物1：1，并与含有1U南极磷酸酶的HipH缓冲液结合。
2. 在30℃孵育1.5小时。
3. 模拟处理的对照物应与65℃的热灭活磷酸酶孵育30分钟。
4. 亲和纯化使用N-WASP VCA偶联至活化的CH-Sepharose的去磷酸化的ARP2/3复合物。
5. 用ARP2/3洗脱缓冲液从Sepharose中洗脱ARP2/3复合物。
6. 缓冲液A透析ARP2/3在4°C过夜。
体外磷酸化测定
1. 在1.5ml微量管中准备以下反应：
  
  表1.磷酸化测定的反应
2. 在37℃下在水浴中孵育反应30分钟。
3. 在磷酸酶试管中，加入5μl5x HipH缓冲液，加入2μl南极磷酸酶，浓度为5000 U/ml（最终10 U），并在30°C水浴中再孵育1 h。
4. 通过加入5μl5x Laemmli加载缓冲液停止反应。
用抗磷酸腺嘌呤抗体通过蛋白质印迹检测磷酸化水平
1. 以12％准备两种SDS-PAGE凝胶。
2. 在干燥加热器中将样品在100℃下加热5分钟。
3. 加入20μl加热的样品和5μl蛋白质梯度凝胶，并在SDS-PAGE迁移缓冲液中以35mA电泳，凝胶电泳约45分钟。
  注意：迁移的电流和时间取决于凝胶尺寸。
4. 在陪替氏培养皿中用考马斯蓝染色其中一个凝胶。
5. 用第二个凝胶进行蛋白质印迹。

笔记

为了优化细菌蛋白质的表达和纯化，可以在SDS-PAGE后通过考马斯蓝染色分析对应于每个步骤的所有级分。
步骤A13的细菌颗粒可以在-80℃冷冻。
对于我们的ARP2/3磷酸化测定，我们使用Sigma的抗磷酸核糖体抗体。然而，我们发现抗体标记是不一致的，需要优化实验条件。为了测试磷酸化活性，我们发现来自Cell Signaling（＃9381）的多克隆磷酸苏氨酸抗体显示出更一致的标记模式，并且更具体地用于标记。
蛋白印迹分析的几个步骤可以进行一夜;转移（0.2mA/cm 2）;阻塞（4℃）;或与第一抗体孵育（4℃）
戴手套来保护样品免受蛋白酶和/或污染蛋白质的影响

食谱

LB培养基+氨苄青霉素（100μg/ml）+卡那霉素（25μg/ml）
0.2 ml 100mg/ml氨苄青霉素储备液
25μl50 mg/ml卡那霉素储备液
200毫升LB培养基

LB培养基
20克LB培养基（Lennox）
1L的dH 2 O
等份由200毫升
通过高压消毒灭菌
100毫克/毫升氨苄青霉素储备溶液
5克氨苄青霉素
50ml dH 2 O
等待并冻结解决方案直到需要
50毫克/毫升卡那霉素储备溶液
2.5克卡那霉素
50ml dH 2 O
等待并冻结解决方案直到需要

0.1 M IPTG
238毫克IPTG
10ml dH 2 O
等待并冻结直到需要
10x PBS（1升）
80克NaCl
2克KCl
14.4g Na 2 HPO 4
2.4g KH 2 PO 4
将pH调节至7.4
将dH ₂ O添加到1 L
1x PBS（1升）
100毫升10倍PBS
900毫升的dH 2 O -/-
GST洗脱缓冲液
50 mM Tris HCl pH 8.0
10 mM谷胱甘肽
透析缓冲液
50 mM Tris HCl pH 7.5
150 mM NaCl
10％甘油
ARP2/3洗脱缓冲液
10mM Tris，pH 8.0
400mM MgCl 2
ARP2/3存储缓冲区
1 mM HEPES
1 mM DTT
10％甘油
调节pH至7.0
10x磷酸化缓冲液
250mM Tris HCl pH 7.5
50mM MnCl 2
50 mM DTT
ATP溶液为0.5mg/ml 1毫克ATP
2ml dH 2 O
5x HipH缓冲区
50mM Tris pH 8.0
1mM Mg 2 Cl 2
0.1mM ZnCl 2
缓冲区A 10x解决方案
500 mM KCl
20mM MgCl 2
10 mM ATP
100mM Tris，pH7.5
5x Laemmli加载缓冲区
5 ml 10％SDS
6.25ml 0.5M Tris HCl pH6.8
5毫升甘油
7.5ml dH 2 O
1次溴酚蓝
2.5μl1 Mβ-巯基乙醇
12％SDS-PAGE凝胶（2微型凝胶）

堆积凝胶
1ml 30％ProtoGel（30％丙烯酰胺，0.8％双丙烯酰胺）
1.25ml 0.5M Tris HCl pH6.8
2.65ml dH 2 O 50μl10％SDS
50μl10％APS
5μlTEMED
分离凝胶
4ml 30％ProtoGel（30％丙烯酰胺，0.8％双丙烯酰胺）
2.5ml 1.5M Tris HCl pH8.8
3ml dH 2 O O// 100μl10％SDS
100μl10％APS
10μlTEMED

迁移缓冲区
25 mM Tris
192mM甘氨酸
0.1％SDS
染色溶液
10％冰醋酸
40％乙醇
0.04％考马斯亮蓝R-250
解决方案
10％冰醋酸
5％乙醇
转移解决方案1
300 mM Tris
20％甲醇
转移解决方案2
25 mM Tris
20％甲醇
转移解决方案3
25 mM Tris
40mM 6-氨基己酸
20％甲醇
组装半干运输
阴极（ - ）

阳极（+）
TBS
100 mM Tris
150 mM NaCl
将pH调节至8
TBS-5％BSA
0.5克BSA
10毫升TBS
TBS-0.1％吐温20
1ml吐温20
1 L TBS
抗磷酸核糖抗体溶液
PBS-5％BSA-0.1％吐温20
单克隆小鼠抗磷酸苏氨酸抗体（1/500）
抗小鼠过氧化物酶抗体溶液
TBS-5％BSA-0.1％吐温20
山羊抗小鼠IgG过氧化物酶抗体（1/5,000）

致谢

这项工作是在里昂大学的LABEX ECOFECT（ANR-11-LABX-0042）的框架内进行的，由法国国家研究机构（ANR-11-IDEX-0007）运营的计划投资项目（ANR-11-IDEX-0007） ANR）。这项工作由国家科技中心（UMR 5308），国立雷神学院（U1111）和里昂大学1所资助。
该协议源自以前描述的协议：（Hervet等人，2011; Zuchero，2007和LeClaire等人，2008）

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