材料和试剂

移液器提示（康宁，目录号：4860）
离心管（Corning，目录号：430290）
厚壁聚碳酸酯管（Beckman Coulter，目录号：343775）
盖片（Sigma-Aldrich，目录号：Z692263）
显微镜幻灯片（Fisher Scientific，目录号：S17466A）
盖玻片（Fisher Scientific，目录号：S175211A）
鸟苷-5' - [（α，β） - 甲基]三磷酸（GMPCPP）（10mM）（Jena Bioscience，目录号：NU-405S）
微管蛋白（CYTOSKELETON，目录号：TL238A）
罗丹明微管蛋白（CYTOSKELETON，目录号：TL590M）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D9779）
N-乙基马来酰亚胺（Sigma-Aldrich，目录号：E3876）
鸟苷5'-三磷酸（GTP）（Sigma-Aldrich，目录号：G8877）
氯化氢（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：295426）
酪蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：C7078）
ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A6419）
紫杉醇（紫杉醇）（Sigma-Aldrich，目录号：T7402）
哌嗪-N，N'-双（2-乙磺酸）（PIPES）（Sigma-Aldrich，目录号：P6757）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M4880）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：E3889）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich：P5405）
蛋白酶抑制剂：
抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A3428）
苄脒（Sigma-Aldrich，目录号：B6505或12072）
注意：产品"B6505"已经停产。
消化抑素A（Sigma-Aldrich，目录号：P5318）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
亮肽素（Sigma-Aldrich，目录号：L2884）
大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）（Sigma-Aldrich，目录号：T6522）
叔戊基甲基醚（TAME）（Sigma-Aldrich，目录号：283096）
过氧化氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：C1345）
葡萄糖氧化酶（Sigma-Aldrich，目录号：C6766或G7141）
注意：产品"C6766"已经停产。
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：D9434）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P5368）
BRB80缓冲溶液（参见食谱）
缓冲液L（见配方）
防褪色解决方案（见配方）

设备

微量移液器
2-20μl（Sigma-Aldrich，目录号：Z717304）
10-100μl（Sigma-Aldrich，目录号：Z717312）
超离心机（Beckman Coulter，型号：TLA-100）
NanoDrop（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，型号：NanoDrop ^TM 2000）
荧光显微镜（Nikon Instruments，型号：Eclipse E600）
水浴（Thermo Fisher Scientific，型号：Precision ^TM通用浴，目录号：TSGP02）

软件

ImageJ（版本1.51J， https://imagej.nih.gov/ij/）

程序

极性标记微管
1. 使明亮的GMPCPP种子，作为微管聚合的"底漆"以及微管负端的指示剂。
2. 制备N-乙基马来酰亚胺微管蛋白
3. 使暗淡的伸长混合物
4. 使极性标记为微管。
滑翔测定
1. 做玻璃室
  1. 用HCl洗涤盖玻片（22×22mm），用HCl洗涤24小时，并用ddH 2 O洗涤10分钟，每次3次。空气干燥盖玻片24小时。
  2. 使用顶部和底部的两片双面胶带将盖玻片连接到玻璃滑块（75 x 25 mm）上。两侧应有开放狭缝（图1）。
    
    图1.使用双面胶带的玻璃滑动室的图示
  3. 将25μl1mg/ml酪蛋白流入室中，放置5分钟。酪蛋白作为运动蛋白锚定垫。
  4. 用3 x 20μl的缓冲液L冲洗未结合的酪蛋白
  5. 在10-100nM纯化的运动蛋白（缓冲液L）中流动，并使其静置5分钟。从杆状病毒表达系统表达和纯化全长驱动蛋白运动蛋白
  6. 用3×20μl缓冲液L冲洗脱粘蛋白
  7. 流出25μl极性标记的微管，以1/250稀释进入腔室。
    对于100μl体积，混合95.4μl缓冲液L，1μl100mM ATP，1μl1mM紫杉醇，2μl抗褪色剂，0.2μl1M DTT和0.4μlMT。
2. 观察荧光显微镜下的微管运动（Nikon E600，激发波长，547nm;发射波长，576nm，另见视频1）。
  
  Video 1. Example of microtubule gliding assay

数据分析

图2说明滑翔测定的原理。将运动蛋白固定在盖玻片上，然后将等分的荧光微管引入室中并被马达捕获。单个荧光微管以单向方式连续移动。如果电动机是正端导向的，微管本身将以负端导向方向移位，反之亦然。

图2.滑翔测定图。将全长运动蛋白固定在盖玻片上，然后将极性标记的微管引入腔室。在荧光显微镜下观察微管运动
图3显示了移动微管的正端导向马达。微管处于负端引导方向。 ImageJ用于测量微管运动的距离，随后计算速度

图3.滑翔测定中极性标记的微管易位。由纯化的驱动蛋白-5蛋白驱动的MT滑移。 MT是负端领先，这表明驱动蛋白-5是一个正端导向的马达。比例尺=5μm（Tao等人，2006）。

笔记

在滑翔测定中，运动蛋白必须新鲜纯化，以确保最大程度的活动
在极性标记微管的同时，建议同时制备光亮的GMPCPP种子和昏暗的伸长率混合物。在种子制作之后，需要加入明亮的种子混合物到暗淡的伸长率混合物。

食谱

BRB80缓冲溶液
1.80 mM PIPES
1mM MgCl 2
1mM EGTA，pH6.8
缓冲区L
1.20 mM Tris
75 mM KCl
2 Mm MgCl 2
1 mM DTT
0.1 mM ATP
将pH调节至8.0
蛋白酶抑制剂（终浓度：抑肽酶2μg/ml;苯脒20μg/ml;亮肽素1μg/ml;抑胃酶A，1μg/ml; PMSF，0.1mM; SBTI，100μg/ml; TAME， μg/ml），在使用前加入
防褪色解决方案

混合10 mg过氧化氢酶，3 mg葡萄糖氧化酶，180.2 mg葡萄糖，100μl1 M DTT，1.902 mg EGTA和100μl10x PBS
填充ddH ₂ O至1 ml
等分成20μl，并储存在-80℃

致谢

这种方法是从陶等人采用的。（2016）和陶等人。（2010）。上述工作由NIH授予GM046409资助给W.S. NIH将GM 55507授予J.M.S.

参考文献

Coppin，CM，Pierce，DW，Hsu，L.and Vale，RD（1997）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9238012"target ="_ blank">驱动蛋白机械循环的负载依赖性。 Proc Natl Acad Sci USA 94（16）：8539-8544。
Tao，L.，Fasulo，B.，Warecki，B。和Sullivan，W。（2016）。 Tum/RacGAP用作激活Pav/kinesin-6电机的开关。 7：11182.
Tao，L.，Mogilner，A.，Civelekoglu-Scholey，G.，Wollman，R.，Evans，J.，Stahlberg，H.and Scholey，JM（2006）。< a class ="ke-insertfile" href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17141610"target ="_ blank">同源三聚体驱动蛋白-5，KLP61F，束状微管，并在动力测定中拮抗Ncd。 > Curr Biol 16（23）：2293-2302。
Tao，L.and Scholey，JM（2010）。有丝分裂马达的纯化和测定。 51（2）：233-241。