材料和试剂

Greiner Petri菜（60 x 15毫米）（Greiner Bio One International，目录号：628161）
显微镜滑动75 x 25 x 1 mm（Marienfeld-Superior，目录号：10 006 12）
显微镜盖玻璃18 x 18毫米（Marienfeld-Superior，目录号：01 010 30）
使用以下转基因线虫来监测线粒体：IR1631：N2; Ex003 TOMM-20 :: Rosella; pRF4]，R1284：N2; em> [p lgg-1 DsRed :: LGG-1; p myo-2 GFP]）
大肠杆菌OP50菌株（从Caenorhabditis 遗传学中心获得）
70％的EtOH
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（EMD Millipore，目录号：104873）
磷酸氢二钾（K 2 HPO 4）（EMD Millipore，目录号：137010）
氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：106404）
蛋白胨（BD，Bacto ^TM，目录号：211677）
链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：S6501）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：05040）
胆固醇储备溶液（SERVA Electrophoresis，目录号：17101.01）
氯化钙脱水（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：C5080）
硫酸镁（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M7506）
制霉菌素储备溶液（Sigma-Aldrich，目录号：N3503）
二磷酸氢钠（Na 2 HPO 4）（EMD Millipore，目录号：106586）
左旋咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：L9756）
百草枯（Sigma-Aldrich，目录号：856177）
羰基氰基间氯苯腙（CCCP）（Sigma-Aldrich，目录号：C2759）
二甲基亚砜细胞培养级BC（DMSO）（AppliChem，目录号：A3672,0250）
磷酸盐缓冲液（1M;无菌，见食谱）
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板（参见食谱）
M9缓冲区（见配方）
左旋咪唑（0.5 M，见食谱）
M9-左旋咪唑溶液（20mM溶液，参见食谱）
百草枯（0.5 M，见食谱）
羰基氰化物m-氯苯腙（49mM; CCCP，参见食谱）

设备

紫外线交联剂（Vilber Lourmat，型号：BIO-LINK-BLX-E365）
蔡司AxioImager Z2落射荧光显微镜（Zeiss，型号：Zeiss AxioImager Z2）
奥林巴斯DP71 CCD相机（Olympus，型号：Olympus DP71）
蔡司AxioObserver Z1共聚焦显微镜（Zeiss，型号：Zeiss AxioObserver Z1）
解剖立体显微镜（Olympus，型号：SMZ645）
温度稳定的孵化器（AQUA ^® LYTIC培养箱20°C）

软件

奥林巴斯CELL-A软件
蔡司ZEN 2012软件
Image J（ https://imagej.nih.gov/ij/ ）
Microsoft Office 2011 Excel（Microsoft Corporation，Redmond，USA）
GraphPad Prism软件包（GraphPad Software Inc.，San Diego，USA）

程序

线虫种群的增长和同步
1. 选择L4转基因动物的L4幼虫，其表达线粒体靶向罗莎氏菌（mtRosella）或共同表达线粒体靶向GFP（mtGFP）以及与体内壁肌细胞中与DsRed融合的自身体标志物LGG-1， E.大肠杆菌（OP50）种子NGM板。每个线虫菌株至少使用三个板块。
2. 在20°C的标准温度下孵育线虫。
3. 四天后，板块含有混合动物种群。
4. 通过挑选L4转基因幼虫并将其转移到单独的新鲜E上来同步线虫。大肠杆菌（OP50）接种板（Palikaras，K.and Tavernarakis，N。[2016]。细胞内ATP检测在秀丽隐杆线虫。 6（23）：e2048; Palikaras，K.and Tavernarakis，N。[2016]。测量秀丽隐杆线虫中的氧消耗率生物方案6（23）： e2049）
5. 每板加入20只L4幼虫。对于每个实验条件，使用至少五块板（见注1）
氧化和线粒体应激测定
1. E。E。大肠杆菌（OP50）细菌通过使用UV交联剂（UV照射15分钟; 0.5J）接种在NGM平板上。
2. 将百草枯或CCCP分别以总琼脂体积的8mM和15μM终浓度添加到接种的NGM板的顶部。百草枯和CCCP是哺乳动物细胞中众所周知的线粒体诱导剂（Narendra等人，2010）。
3. 轻轻地旋转板材，让每种药物均匀扩散到整个表面
4. 让板在室温下干燥。
5. 在含有百草枯或含CCCP的平板上转移成年成年转基因动物的2日龄或4日龄
6. 在20°C孵育转基因动物
7. 每天接触两天后，准备线虫进行显微镜检查
安装线虫成像
1. 在2％琼脂糖垫上加入10μlM9-左旋咪唑缓冲液（20mM终浓度，见附注2）的液滴（见注3）。
2. 收集具有眉毛/睫毛头发的转基因动物，并将其置于M9-左旋咪唑液滴中，固定转基因动物进行成像（见注4）。
3. 轻轻地将盖玻片放在顶部的压机上。用Zeiss AxioImager Z2表面荧光显微镜或Zeiss AxioObserver Z1共焦显微镜对样品进行显微镜检查。
转基因线虫成像
1. 使用连接到显微镜的相机捕获单个转基因动物或单体壁肌细胞。
2. 获得（a）通过使用Zeiss AxioImager Z2表面荧光显微镜或执行（b）表达mtGFP的整个单体壁肌肉细胞与自身体标志物DsRed的（b）z堆叠方法，在体壁肌肉细胞中表达mtRosella的整个转基因线虫的荧光图像： LGG-1采用Zeiss AxioObserver Z1共焦显微镜。
3. 应该记录成像参数，例如显微镜和相机设置（使用透镜和放大镜，曝光时间，分辨率，激光强度，增益等等），并在成像过程中保持相同。
4. 从每种方法（a或b）保存收集的图像，并进行数据分析。
从成像过程分析数据
1. 使用ImageJ软件从（a）方法获取的过程图像，以测量转基因蠕虫每个荧光图像的平均像素强度值和总面积。注意头部区域的体壁肌细胞，避免肠道自体荧光（图1和图2;见注5）。手动分析感兴趣区域：
  1. 通过'image'和'color'下拉菜单选择'split channel'命令来转换图像。
  2. 使用"手写选择"工具封闭荧光区域。
  3. 通过"分析"下拉菜单选择"测量"命令来执行像素强度分析。
  4. 通过使用Microsoft Office 2011 Excel软件包（Microsoft Corporation，Redmond，USA）将所选区域值除以规格化像素强度值。
  5. 在归一化时，计算GFP至DsRed比率。
    
    图1.氧化和线粒体应激的米氏感染。在体壁肌细胞中表达mtRosella的转基因线虫暴露于百草枯或CCCP。通过降低pH敏感性GFP与pH不敏感的DsRed（n = 100; *** <0.001 <单因素方差分析）之间的比率来表示远端诱导。箭头指出肠道自体荧光。尺寸棒表示20μm。使用10x物镜获得图像。误差条表示SEM值。
    
    图2.使用ImageJ软件进行图像分析 1.使用ImageJ软件打开获取的GFP信号图像; 2.通过'image'和'color'下拉菜单选择split channel'命令来转换图像;保持"绿色通道"的形象; 4.使用'freehabnd selection'工具包围荧光区域（头部区域）; 5.通过"分析"下拉菜单选择"测量"命令进行像素强度分析; 6.使用获得的DsRed信号图像执行相同的分析途径。
2. 使用Zeiss ZEN 2012软件从（b）方法收集的过程图像，以发现被自噬吞噬的线粒体，称为mitoautophagosomes。
  1. 通过手动计算线粒体（mtGFP）和体细胞标志物（DsRed :: LGG-1）之间的共定位事件来确定线粒体体细胞数量，显示在每个体壁肌细胞堆叠中（图3）。
  2. 使用Microsoft Office 2011 Excel软件包（Microsoft Corporation，Redmond，USA）分析数据。
    
    图3.在体内监测mitoautophagosomes形成。转基因线虫与体内壁肌肉细胞中的线粒体靶向GFP（mtGFP）一起共表达与自身吞噬蛋白LGG-1融合用DsRed，用百草枯或CCCP治疗。 Mitophagy刺激通过GFP和DsRed信号的共定位来表示（对于每组图像，线粒体在上面是绿色的，下面是红色的自噬体，底部的合并图像）。氧化和线粒体应激（n = 50; *** <0.001），单因素方差分析（mitoautophagosomes）的数量增加。尺寸棒表示20μm。使用40x物镜获得图像。误差条表示SEM值。

数据分析

对于每个菌株或病症，使用至少100只动物或50只体壁肌细胞获得更准确的结果。
每个测定应重复至少三（3）次。
使用学生的 t 测试，具有 P 的重要性截止级别0.05用于两组之间的比较。
使用单因素（ANOVA）方差分析，并通过事后Bonferroni检验进行多次比较。

笔记

将选择的转基因动物每两天转移到新种植的NGM板上，以避免后代并防止由于缺乏食物而导致的饥饿。卡路里的剥夺和饥饿诱发线虫病。因此，应该使用充足的动物。
使用M9缓冲液而不是水确保线虫有利的渗透环境。
左旋咪唑是一种温和的麻醉剂，需要固定线虫。避免可能干扰代谢过程的麻醉剂，如叠氮化钠。叠氮钠通过抑制线粒体呼吸链和能量产生的扰动诱导线粒体和氧化应激。因此，叠氮化钠可能诱发丝裂霉菌
拿一个牙签，将眉毛/睫毛粘在头上。让它在室温下干燥。然后，使用此工具选择线虫。在使用眉毛/睫毛之前，请始终使用70％的EtOH对其进行消毒。
肠道自身荧光在C老化过程中增加。线虫。因此，在成像过程中应避免靠近肠道的体壁肌细胞

食谱

磷酸盐缓冲液（1M）

对于1L，在蒸馏水中溶解102.2g KH 2 PO 4和57.06g K 2 HPO 4，填充1 L.这是一个1M溶液，pH 6.0
高压灭菌并保持室温

线虫生长培养基（NGM）琼脂板

混合3g NaCl，2.5g细菌蛋白胨，0.2g链霉素，17g琼脂并加入900ml蒸馏水。高压灭菌器
让凉爽至55-60°C
加入1ml胆固醇储备溶液，1ml 1M CaCl 2，1ml 1M MgSO 4，1ml制霉菌素储备溶液，25ml无菌1M磷酸盐缓冲液，pH 6.0，蒸馏无菌水至1升
倾倒约8毫升培养基每培养皿，并离开巩固
将板保持在4°C直到使用

M9缓冲区

将3g KH 2 PO 4，6g Na 2 HPO 4，5L NaCl的1L蒸馏水溶解水。高压灭菌器
冷却并加入1ml 1M MgSO 4（无菌）
在4°C存储M9缓冲液

左旋咪唑（0.5M）

将1.2 g左旋咪唑溶于10ml蒸馏水中
在4°C储存左旋咪唑溶液

M9-左旋咪唑（20mM）

在10ml M9缓冲液中稀释400μl0.5M左旋咪唑
在4°C储存M9-左旋咪唑溶液

百草枯（0.5 M）

将1克百草枯溶于8毫升蒸馏水中
准备400毫升的等分试样，并将其储存在4°C

羰基氰基间氯苯腙（49mM; CCCP）

将100mg CCCP溶于10ml DMSO中
准备1ml的等分试样并将其储存在-20℃

致谢

这项工作由欧洲研究委员会（ERC），欧盟委员会7（支持）框架计划和博多基基基金会博士后研究奖学金资助。该协议已经从Palikaras等人改编。（2015），Nature 521,525-528。

参考文献

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