材料和试剂

移液器提示（任何品牌）
15个聚丙烯圆锥形塑料管（DOT SCIENTIFIC，PerformR ^®，目录号：416-PG）
50ml聚丙烯圆形塑料管（DOT SCIENTIFIC，PerformR ^®，目录号：451-PG）
12孔组织培养板（CELLTREAT Scientific Products，目录号：229112）
5 ml聚苯乙烯圆底管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352052）}
显微镜盖玻片18毫米（Fisher Scientific，Fisherbrand ^TM，目录号：12-545-100）
盖片（VWR，目录号：48382-041）
显微镜幻灯片（Fisher Scientific，目录号：22-034-486）
1.7米微量离心管（DOT SCIENTIFIC，目录号：RN1700-GMT）
96孔固体白色平底聚苯乙烯微孔板（Corning，目录号：3917）
96孔组织培养板（CELLTREAT Scientific Products，目录号：229196）
一次性比色皿（Eppendorf，目录号：Z605050）
1 ml一次性注射器（BD，目录号：309659）
96孔组织培养皿
U937人单核细胞系
TZM-bl人阴道上皮细胞系
Jurkat人T淋巴细胞细胞系
V428（HPV-16 E6/E7转化人阴道上皮细胞系）
VK2（HPV-16 E6/E7转化人阴道上皮细胞系）
人类精液
无细胞HIV-1病毒库，复制能力
ExoQuick（系统生物科学）
磷酸盐缓冲盐水，DPBS 1x;不含CaCl 2和MgCl 2（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM）
脂质体（Lipofectamine 2000）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：11668019）}
PKH67Green荧光试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：MINI67）
PKH26Red荧光试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：MINI26）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM）
快速入门Bradford蛋白测定试剂盒1（Bio-Rad Laboratories，目录号：500-0201）
罗斯韦尔公园纪念研究所（RPMI）1640（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM）
青霉素/链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM）
丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM）
角质形成细胞无血清培养基（KSFM）（Thermo Fisher Scientific）
人重组表皮生长因子1-53（Thermo Fisher Scientific）
牛垂体提取物（BPE）（Thermo Fisher Scientific）
0.25％胰蛋白酶-EDTA，酚红解离试剂（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25200-056）}
胶原，大鼠尾巴1型（Sigma-Aldrich，目录号：C3867）
多聚甲醛（2％）（Fisher Scientific，目录号：T353-500）
Vectashield具有DAPI的抗褪色剂（Vector Laboratories，目录号：H-1200）
Exosome-human CD63 Isolation/Detection（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10606D）}
白蛋白，牛馏分V（BSA）（RPI，目录号：A30075-100.0）
抗人CD63-FITC（BioLegend，目录号：353005）
醛/硫酸酯乳胶珠（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：A37301）}
MHC-II单克隆抗体
同种型对照抗体（小鼠IgG1）
甘氨酸（RPI，目录号：G36050-500.0）
抗人CD63-PE（BioLegend，目录号：353003）
Triton-X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
乙酰硫基胆碱氯化物（Sigma-Aldrich，目录号：A5626）
5,5'-二硫代双-2-硝基苯甲酸（Sigma-Aldrich，目录号：D8130）
无水碳酸钠（RPI，目录号：S25025-500.0）
NuPAGE LDS样品缓冲液（4x）（Thermo Fisher Scientific，Novex ^{TM，目录号：NP0008）}
NuPAGETM Novex ^{TM 4-12％Bis-Tris蛋白凝胶，1.5mm，10孔（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：NP0335PK2）}}
NuPAGE MOPS SDS运行缓冲液（20x）（Thermo Fisher Scientific，Novex ^{TM，目录号：NP0001）}
Pierce Silver Stain Kit（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：24612）
RNeasy Mini Kit（QIAGEN，目录号：74104）
RNase-Free DNase Set（QIAGEN，目录号：79254）
大容量cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，目录号：4368814）}
QuantiFast SYBR Green PCR Kit（QIAGEN，目录号：204054）
琼脂糖（RPI，目录号：A20090）
溴化乙锭溶液（Bio-Rad Laboratories，目录号：1610433）
1x TAE缓冲区
Steady-Glo（Promega，目录号：E2510）
NuPAGE样品还原剂（10x）（Thermo Fisher Scientific，Novex ^{TM，目录号：NP0004）}
MES（Sigma-Aldrich，目录号：M2933）
1 N NaOH（Avantor Performance Materials ，J.T.Baker ，目录号：563502）
蒸馏水（任何品牌）
Exosome-depleted FBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：26140079）}
MTT试剂（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：M6494）}
Nonidet P-40替代品（RPI，目录号：N59000）
盐酸（HCl），ACS试剂，37％（Sigma-Aldrich，目录号：258148）
异丙醇（Fisher Scientific，目录号：A416-4）
Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM）
外来体消耗的FBS（参见食谱）
用于蛋白质足迹的裂解样品缓冲液（参见食谱）
存储缓冲区（请参阅配方）
MES缓冲区（见配方）
FACS洗涤缓冲液（参见食谱）
MTT试剂（参见食谱）
MTT溶剂（见配方）

设备

移液器（任何品牌）
无菌镊子（任何品牌）
离心机（Eppendorf，型号：5415 D）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima L-90K）
SW40Ti转子（Beckman Coulter，目录号：331362）
用于SW41Ti转子的多聚物离心管14 x 89 mm（Beckman Coulter，目录号：344059）
37℃，5％CO 2细胞培养箱（NuAire，型号：NU-5510）
FACSCalibur流式细胞仪（BD）（见激光和滤光片规格说明）
FACSVerse流式细胞仪（BD）（见激光和滤光片规格说明）
FACSAria流式细胞仪（BD）（见激光和滤光片规格说明）
激光扫描共焦显微镜（Nikon Instruments，型号：Eclipse TE2000）
1.7 ml管的磁选机
旋转搅拌机
酶标仪（Tecan Trading，型号：Infinite ^® M200 Pro）
DynaPro Nanostar（Wyatt Technologies，型号：DynaPro Nanostar）
NanoSight LM10（Malvern Instruments，型号：NanoSight LM10）
NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific）
SW60 Ti转子（Beckman Coulter，目录号：335649）
用于SW60Ti转子的聚对苯二甲酸酯离心管11 x 60 mm（Beckman Coulter，目录号：355636）
7500快速实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，型号：7500快速实时PCR系统）
发光计（BioTek Instruments，型号：Synergy H1 Hybrid Reader）
层流罩
SW32 Ti转子（Beckman Coulter，型号：369650）
用于SW32Ti转子的聚对苯二甲酸酯离心管25 x 89 mm（Beckman Coulter，目录号：344058）
pH计（任何品牌）
凝胶运行罐（Thermo Fisher Scientific，Novex ^{TM，型号：XCell SureLock ^® Mini-Cell，目录号：EI0001）}
Sephacryl S300-HR 16/60凝胶过滤预填柱（GE Healthcare目录号：17-1167-01）
BioLogic DuoFlow工作站（Bio-Rad Laboratories）
BioLogic BioFrac馏分收集器（Bio-Rad Laboratories）
凝胶电泳水平仪（Bio-Rad Laboratories，型号：Wide Mini-Sub Cell GT Cell，目录号：1704468EDU）
用于微量离心管的干式加热器（Thermo Fisher Scientific）

软件

FlowJo分析软件（TreeStar）
BioLogic DuoFlow软件版本5.3（Bio-Rad Laboratories）
动力软件（Wyatt Technology）
NTA软件（Malvern Instruments）

程序

获取人类精液样品
本研究利用现有的人体标本（精液），因此不是人类受试者的研究。样品从常规检查中丢弃，不与任何标识符相关。
1. 通过干手动刺激和射精将精液收集到无菌的15ml聚丙烯锥形管中。
2. 将样品在室温下储存30分钟以促进液化，然后在4℃下以1,000×g离心10分钟以沉淀精子。
3. 从含有精子的颗粒中取出精浆。可以丢弃或储存颗粒用于下游分析。
4. 将精液中的血浆样品储存在-80°C，直到ExoQuick进行外源体纯化或超速离心。我们发现两种纯化方法之间没有明显差异。
ExoQuick净化外来体
1. 解冻精液血浆样品，然后在400℃离心2000分钟，在4℃下在50ml锥形管中离心15分钟。将上清液转移到新管中，并在4℃下在10,000ml锥形管中以10,000xg再次离心30分钟以沉淀细胞碎片。
2. 将澄清的精液血浆置于新鲜的50ml锥形管中，并以4：1的比例（澄清的精浆/ExoQuick）添加ExoQuick。通过倒置混合，并在4℃下孵育过夜（12-24小时）。
3. 在4℃下将澄清的精浆等离子体/ExoQuick混合物以1,500×g离心30分钟。
4. 取出上清液（不含外来物质的澄清精液等离子体和ExoQuick），并在4℃下以1,500 x g重复离心10分钟，而不会重新沉淀。
5. 去除残留的上清液。
6. 将PBS中的外来体颗粒重悬于原始体积的精浆中的1/10，通过Bradford测定法定量蛋白质浓度，并分批。
外植体超速离心纯化
1. 在PBS中稀释澄清的精浆50％，并在4℃下以100,000×g超速离心2小时，以使用SW41Ti转子来沉淀外来体。
2. 将PBS中的外来细胞颗粒洗涤三次，以100,000×g超速离心每次洗涤30分钟（1.5小时）。应使用一定体积的PBS，完全填充超速离心管，以避免管子塌陷。
3. 将PBS中的外来体重悬于原始体积的精浆中的1/10，通过Bradford测定法定量蛋白质浓度，并分批。
荧光标记的外来体，脂质体对照或PBS对照
1. 荧光标记PBS对照，Lipofectamine 2000衍生的脂质体对照或使用PKH67Green或PKH26Red试剂盒的外来体，根据制造商的说明书进行以下修改：将1mg纯化的外来体或脂质体对照或等体积的PBS加入到250μlPBS中，并与在SW41Ti超速离心管中加入250μl稀释剂C
2. 在黑暗中室温（RT）下，在独立的管中，将5μlPKH67Green或PKH26Red亲脂性染料加入到500μl稀释剂中，并在黑暗中RT执行所有后续步骤。
3. 将含有染料和稀释剂C的管与含有外来体的管或PBS中的稀释剂C和SW41Ti超速离心管中的稀释液C组合。通过手动移液快速混合。在室温下在黑暗中孵育5分钟，并在5分钟孵育期间涡旋两次。
4. 孵育5分钟后，将含有染料，外来体或对照的超离心管和Diluent C以1：1的比例添加到无离子的FBS中孵育1分钟，以占据未结合的染料。
5. 将溶液以100,000×g超速离心30分钟。丢弃上清液。
6. 将含有染料标记的外来体或对照物的沉淀重悬在PBS中，转移到另一个SW41Ti超速离心管中，并以100,000×g超速离心洗涤三次，每次洗涤30分钟。每次洗涤后，将PBS再悬浮的颗粒转移到新的SW41Ti超速离心管中，以尽量减少未结合染料的转移。应使用一定体积的PBS，以完全填充超速离心管，以避免管子塌陷。
7. 最后洗涤后，取出上清液，并将沉淀物重新悬浮于PBS中至原体积的外来体。使用Bradford Protein Assay Kit定量染色标记的外来体或对照样品，等分，并在黑暗中存放于-80°C直至使用。
用于荧光外来体内化的细胞培养物
1. 在组织培养皿中培养人单核细胞和淋巴细胞细胞系，在补充有10％外来物质消耗的FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1mM丙酮酸钠和0.3mg/ml L-谷氨酰胺的RPMI的5％ CO 培养箱中37℃
2. 在组织培养皿中培养TZM-bl阴道上皮细胞系，在补充有10％外来物质消耗的FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1mM丙酮酸钠和0.3mg/ml L-谷氨酰胺的DMEM的组织培养皿中％CO 2培养箱在37℃。
3. 在补充有0.1ng/ml预质量的人重组表皮生长因子1-53,0.05mg/ml BPE，100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的角质细胞血清游离培养基中的组织培养皿中生长VK2和V428阴道上皮细胞系。
4. 生长12个组织培养皿中的所有细胞类型。在1ml体积的每种细胞类型的正确细胞培养基中，每孔1×10 5个细胞的细胞（见注1）。
5. 在5％CO 2培养箱中在37℃下将细胞暴露于25-100μg/ml的红色或绿色荧光外来体或对照物中0,3,6,9,12或24小时的孵育期。 SE与细胞的孵育应在细胞培养基中完成。与细胞的SE孵育的最终体积将取决于荧光标记后外来体的浓度。
6. 在平板上的1ml PBS中洗涤TZM-bl，VK2或V428贴壁细胞三次，并使用0.5ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA解离试剂从板上分离细胞。用DMEM中的0.5ml 10％无外来物质FBS中和胰蛋白酶。从孔中收集细胞并转移到5ml聚苯乙烯圆底管中。在4℃下以500×g离心5分钟，在1ml PBS中洗涤细胞三次。
7. 在5ml聚苯乙烯圆底管中收集单核细胞和淋巴细胞悬浮细胞。用步骤E5所述的胰蛋白酶处理，并用RPMI中的10％无外来物质的FBS中和。在4℃下以500×g离心5分钟，在1ml PBS中洗涤细胞三次。
8. 使用FACS分析或共焦显微镜评估细胞摄取和外来体内化动力学
表面外来体标记物的检测在这里，我们将描述SE中人CD63的检测，但是该方案可能被修改用于检测SE中其他常见的外来体表面标记物。使用来自Invitrogen的外来体 - 人CD63分离/检测试剂盒，根据制造商的说明书检测SE中的人CD63，其后获得SE：
1. 在0.1％BSA中重悬25μg的SE至总体积为100μl。
2. 通过涡旋30秒重悬抗CD63包被的磁珠。将20μl珠转移到微量离心管中，加入200μl0.1％BSA并涡旋洗涤珠粒。
3. 将含有珠粒的管放在磁铁分离器上1分钟。从磁铁中取出管子之前弃去上清液。
4. 将SE溶液加入洗涤的珠子中，并通过移液混合。
5. 在旋转混合器中，将SE /珠溶液在4℃下孵育过夜（18-20小时）。
6. 将SE /珠子溶液离心3-5秒。
7. 在300μl0.1％BSA中洗涤SE结合的珠子，并通过移液混合，然后将管置于磁体上1分钟，弃去上清液。
8. 从磁铁上取下管子。将洗涤SE结合的珠子在400μl的0.1％BSA中，并通过移液混合。
9. 将管置于磁体上1分钟，然后从磁铁中取出上清液。
10. 将SE结合的珠子重悬于300μl的0.1％BSA中
11. 将100μlSE结合的珠转移到新的微量离心管中。加入5μl抗人CD63-FITC（BioLegend），并通过移液混合。
12. 将SE界限珠和抗体在室温下在黑暗中振荡板孵育60分钟
13. 将抗体染色的SE结合珠洗涤在300μl0.1％BSA中并通过移液混合。将管放在磁铁上1分钟，弃去上清液，然后从磁铁上取出管子
14. 重复洗涤步骤两次，然后将SE结合的珠子重新悬浮在300μl0.1％BSA中。在FACSVerse仪器和FlowJo（Tree Star）软件（图2）分析之前，将重悬的SE结合珠转移到5ml聚苯乙烯圆底管中。
  
  图2. SE上的CD63表达将25μgSE或PBS载体与α-CD63包被的磁珠孵育过夜以促进结合。在用α-CD63-FITC和FACS分析染色珠粒结合的SE之前，除去未结合的SE。 O/N =一夜。 y轴显示珠的前向散射值（FSC）。
  
  或者，也可以使用非磁珠来检测SE中的常见的外来体标志物。在这里，我们提供使用乳胶珠检测SE中的CD63的说明。
  1. 按照制造商的说明书，将2.5ml重悬浮的，不含表面活性剂的4μm直径的醛/硫酸盐胶乳珠（Invitrogen，Molecular Probes，以下称为胶乳珠）在10ml 0.025M，pH 6.0 2 - （N-吗啉代）乙烯磺酸（MES）缓冲液，在4℃下以3,000xg离心20分钟。
  2. 第二次洗涤后，将乳胶珠重新悬浮于5ml MES缓冲液中
  3. 使用100μl抗体MHC-II MAb或在MES中以1mg/ml的浓度制备的同种型对照抗体在室温下孵育100μl乳胶珠过夜，同时轻轻搅动。
  4. 通过在4℃下以3,000×g离心20分钟，将具有共轭抗体的沉淀胶乳珠子。
  5. 去除上清液（未结合的抗体）
  6. 在1℃PBS（0.1M，pH7.2）中，在4℃下，用共轭抗体洗涤乳胶珠三次，每次3次，持续20分钟。
  7. 将乳胶珠悬浮在100μl储存缓冲液中（见配方）。
  8. 将ExoQuick纯化的外来体（100μg）与* 2×10 5抗体MHC-II或同种型对照包被的胶乳珠在100μlPBS（0.1M，pH 7.2）的最终体积中首先与15 min，然后在4℃温和搅拌下过夜。
    注意：珠粒浓度/ml不同批号。
  9. 通过用含有0.2％甘氨酸的PBS（0.1M，pH7.2）30分钟温育反应停止，使乳胶珠上的任何空位饱和。
  10. 然后将外来体和抗体结合的乳胶珠制备物在FACS洗涤缓冲液中洗涤三次（参见食谱）
  11. 然后将外来体包被的珠粒与适当浓度的与PE（BioLegend）或同种型对照抗体缀合的抗CD63在无光照下在室温下孵育1小时，然后在FACS缓冲液中三次洗涤。
  12. 通过使用FACSAria流式细胞仪（BD）和FlowJo分析软件（TreeStar）分析得到的免疫荧光（图2）。
SE乙酰胆碱酯酶活性
1. 以1：1体积比溶解2％Triton-X-100中的50μgSE。
2. 加入5μlSE/Triton-X反应至96孔平底透明板，重复三次。
3. 以1:1比例合并1.25mM乙酰硫胆碱氯化物（Sigma-Aldrich）和0.1mM 5,5'-二硫代双硝基苯甲酸（Sigma-Aldrich），达到每孔100μl的终体积。向每个含有外来体的孔中加入100μl混合溶液。在将此溶液加入孔中之前，请确保酶标仪达到37°C，反应将在加入后立即开始。
4. 在37℃下以5分钟的间隔读取酶标仪上450nm处的吸光度，总共30分钟（图3）。
  
  图3. SE的50％SE或PBS载体的乙酰胆碱酯酶活性在Triton-X-100中裂解。 AChE活性以5分钟间隔测量，共30分钟。误差条表示标准差。
SE的动态光散射（DLS）
1. 在200μlPBS中稀释0.1mg/ml的SE，并通过DynaPro NanoStar DLS（Wyatt Technologies）在塑料比色杯中使用总体积为150μl的分析尺寸。
2. 使用Dynamics软件完成数据分析。
3. 使用每个外来体样本平均10次测量来确定半径，直径和％强度（图4）。
  
  图4. SE尺寸和浓度估算。 A.动态光散射表示SE的近似直径。使用0.1mg/ml的SE来测量SE的直径。显示群体中外来体直径的范围。 B.来自NanoSight NTA视频剪辑的代表性图像，显示SE颗粒。 C.从NanoSight估计浓度计算出的每ml精液中SE颗粒的近似值。 D.通过NanoSight近似SE尺寸。 N =指外源体纯化组合供体的数量
SE NanoSight纳米粒子跟踪分析（NTA）
1. 制备含有均匀尺寸（100或200nm）聚苯乙烯颗粒的对照悬浮液。
2. 使用悬浮液对齐激光和显微镜的焦点。
3. 将每个SE标本在PBS中连续稀释至最终体积为0.5ml。
4. 使用1ml一次性注射器将0.5ml稀释的SE注入NanoSight LM10 NTA。
5. 分析所制备的连续稀释液的各个成员，直到检测到的原始浓度在仪器的推荐范围内
6. 使用识别的稀释度，记录每个样本的三个30秒的视频。
7. 使用相同的结算重复分析3次，以确保可重复和准确的测量。
8. 使用NTA软件完成收购后分析，以确定SE的规模和集中度。
9. 查看结果选项卡i）跟踪的粒子总数，ii）平均粒子数，以及iii）粒子浓度。
10. 计算每毫升精液的外来体总浓度，考虑用于NanoSight分析的稀释因子（图4）。通过分析每个样品的3个测量的标准偏差来获取误差条
SE分为膜和管腔内容物
1. 用5-10x体积的0.1M碳酸钠pH = 11.5处理100μgSE。混合混合。
2. 在4℃下孵育30分钟至1小时。在这一点上，来自裂解的外来体的总蛋白质可以通过NanoDrop分光光度计在280nm测量。完成以下步骤将裂解的SE分离成膜和腔分数。
3. 将SE /碳酸钠混合物转移到SW60 Ti超速离心管中。用PBS填充体积填充管。
4. 超声离心机在150,000xg下于4℃下1.5-2小时。沉淀物含有膜级分，而上清液含有腔内部分。
5. 取出管腔"上清液"级分。这可以通过Bradford测定进行蛋白质定量后的MW滤光片截留浓度，并在-80℃下进行下游分析或储存直至使用。
6. 在裂解前将PBS中的膜级分重悬于SE的原始体积。通过Bradford测定法定量蛋白质，等分，并存储在-80°C或用于下游分析（图5）。
  
  图5. SE分离为二不同的级分。 SE可以分成膜和腔内成分。
SE蛋白质足迹
1. 在20μlPBS中以3μlNuPAGE溶解样品缓冲液（见Recipes）/7μlSE的比例溶解5μgSE。
2. 在90℃的样品缓冲液中加热SE 10分钟。
3. 在10孔1.5毫米NuPAGE 4-12％Bis-Tris凝胶上加载40μl最大体积。
4. 在NuPAGE 20x MOPS SDS运行缓冲液稀释至1倍的条件下，以200 V运行凝胶约50分钟
5. 银根据制造商的协议（Pierce银色染色试剂盒Thermo Scientific）对凝胶进行染色。
检查SE的完整性和内容
1. 使用至少12μgSE的起始浓度进行RNA提取。
2. 使用Qiagen RNeasy试剂盒根据制造商的说明书提取SE RNA，并使用Qiagen RNase-free DNA酶装置完成可选的DNA酶处理。
3. 用NanoDrop分光光度计测定RNA浓度。为了评估SE的RNA完整性，可以通过使用RNA 6000 Pico芯片的Agilent BioAnalysis运行来分析RNA，如果RNA浓度< 50 ng /μl。如果RNA浓度> 50但< 500 ng /μl，RNA可以使用RNA 6000纳米芯片进行评估（图6）
  
  图6. SE的RNA完整性。从SE提取RNA，并通过Agilent Bioanalyzer分析。
4. 使用高容量cDNA逆转录试剂盒（ABI）使用等效浓度的RNA进行cDNA合成。
5. 使用人类基因特异性引物，通过Quantifast Sybr绿色技术（QIAGEN）和7500快速实时机器扩增CD9，CD63和GAPDH或其他感兴趣的基因。
6. 通过溴化乙锭染色在2％琼脂糖凝胶上显示PCR扩增子。代表性的图像显示在Madison等人，2014年。
SE抑制HIV-1感染性
1. 在补充有10％外来物质消耗的FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1mM丙酮酸钠和0.3mg/ml L-谷氨酰胺的DMEM的DMEM培养皿中，在96孔组织培养皿中培养TZM-bl细胞， CO 培养箱中37℃
2. 将含有8 RT单位HIV-1病毒的100μg/ml SE或PBS载体在37℃下在补充有10％外来物质消耗的FBS，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，1mM钠的DMEM中预孵育100μg/ml SE或PBS载体丙酮酸和0.3mg/ml L-谷氨酰胺。用PBS载体预培养补充的DMEM作为未感染对照。通过涡旋孵育前混合。
3. 从TZM-bl细胞中去除DMEM培养基。加入100μl每孔一次三份SE/HIV-1，PBS载体/HIV-1或PBS载体/DMEM至TZM-bl细胞。
4. 在5％CO 2培养箱中37℃孵育24小时。
5. 通过MTT测定和通过Steady-Glo荧光素酶测定法检测HIV-1感染性的细胞活力（参见附注5;图7）

数据分析

每个实验应通过实验重复至少三次，每次实验重复三次以验证重现性。
平均复制独立实验评价统计学意义。在适当的情况下，将结果与车辆控制进行比较
使用GraphPad软件绘制数据，如Graphpad Prism。对于未以图形方式表示的分析，如Bioanalyzer，蛋白质足迹和FACS分析，可以显示代表性的图像。

笔记

细胞培养
当生长细胞时，为了最小化蒸发，仅在板的内孔中铺板，并用PBS填充最外层的孔。我们建议在使用前将细胞电镀，以使细胞正常化。因为SE会以不同的浓度和细胞类型依赖的方式改变细胞存活力，所以在涉及使用SE的细胞治疗的所有实验中评估细胞的细胞毒性是重要的（Madison等人，2014; Madison 等，，2015）。当评估HIV-1感染性时，这也很重要，因为高浓度的病毒或SE可能对细胞具有细胞毒性并影响结果分析。
外来体存储
我们发现外来体反复冻融降低了功能活性。我们建议隔离后，将外来体等分成各个微量离心管（<100μg），然后冷冻保存以保留功能活性。
丢弃上清液
当造粒或洗涤外来体后丢弃上清液时，我们建议通过移液管抽吸而不是倒置来去除，以确保完全去除。然而，根据使用的浓度，外来物质颗粒可能不总是容易观察到，并且应谨慎使用以不会使颗粒物移动。
无菌
经常可行的是，所有实验步骤都应在层流罩下完成，以确保无菌环境。污染可能影响下游分析。
HIV-1感染性
因为TZM-bl细胞含有背景荧光，因此我们建议以96孔格式每孔铺装10,000个细胞，以使背景荧光素酶表达最小化。根据所使用的细胞系，使用的HIV-1分离物可以根据该细胞系上表达的受体/辅助受体而变化。如果评估不是报告细胞系的细胞感染，可以使用HIV-1基因特异性引物通过qRT-PCR评估感染。数据可以通过测量细胞内或细胞外HIV-1 RT活性来确认（Madison等人，2014; Madison等人，2015）。所有HIV-1实验必须按照生物安全培训和实验室环境要求进行。
SE介导的HIV-1抑制
SE还可以在感染预处理模型中抑制HIV-1感染。在该模型中，生长细胞后，SE在病毒感染前24小时加入到细胞中，并保持对感染的抑制。在其他细胞系如Jurkat，SUPT1，U937，PM1，THP-1，CEM和PBLs的预温育和预处理模型中，SE的HIV-1抑制特征是坚持的（Madison等人 >，2014; Madison 等人，2015）。
流式细胞仪规格
本协议中使用的流式细胞仪系统的激光和滤波器规格如下。
FACSCalibur流式细胞仪（BD）
激光器：空气冷却，氩离子，488nm，15mW
排放检测：
             FL1 530/30
             FL2 585/42
             FL3 670 LP
             FL4 661/16
             SSC 488/10
             FSC 488/10
FACSVerse流式细胞仪（BD）
Lasers: Blue laser, 488 nm, 20 mW, beam spot size 9 x 63 μm
             Red laser, 640 nm, 40 mW, beam spot size 9 x 63 μm
             Violet laser, 405 nm, 40 mW, beam spot size 9 x 63 μm
Emission detection:
             FITC 527/32
             PE 586/42
             PerCp 700/54
             APC 660/10
             SSC 488/15
             FSC 488/10
FACSAria流式细胞仪（BD）
激光器：相干蓝宝石，固态，488nm，20mW
            JDS Uniphase HeNe, air-cooled, 633 nm, 18mW
            Point Source Violet, solid state, 405 nm, 15 mW
Emission detection:
             FITC 530/30
             PE 576/26
             PerCp 695/40
             APC 660/20
             SSC 488/10
             FSC 488/10

食谱

外来体消耗的FBS
使用SW32Ti转子的SW32Ti超速离心管中，在4℃下使用100,000 x g的超离心机FBS 2小时收集上清液，并在4℃下储存长达一周或-80℃保存更长时间
用于蛋白质足迹的裂解样品缓冲液
将250μlNuPAGE 4x LDS样品缓冲液与100μlNuPAGE 10x还原剂混合向SE样品添加混合缓冲液，每7μlSE 3μl缓冲液
存储缓冲区
PBS（0.1M，pH7.2）和0.1％甘氨酸
MES缓冲区
溶解浓度为0.025 M的蒸馏水中的MES。用pH计测定pH值，并用1N NaOH调节pH至6.0。
FACS洗涤缓冲液
PBS中的1％外来体缺失的FBS
MTT试剂
按照制造商的说明书
重新悬浮MTT试剂至PBS中，最终浓度为5 mg/ml
MTT溶剂
0.1％NP-40和4mM HCl的异丙醇溶液

致谢

这项工作得到了国家药物滥用研究所（NIDA）授权1R01DA042348-01（CMO），美国国立卫生研究院（NIH）5T32AI007533-18（至JLW）和NIH T32传染病（MNM）博士后培训资助），共享仪表授权1S10RR025439-01到爱荷华大学中央显微镜核心设施，霍顿全面癌症中心支持授权P30CA086862。作者感谢爱荷华大学的Aloysius Klingelhutz提供V428细胞，给田纳西州中部生殖专业实验室的Bartholomey Konan和Melanie Freeman以及Amy E.T.爱荷华大学医院和诊所（UIHC）体外受精和生殖检测实验室的火花，用于提供预先存在的，未确定的人体供体精液样品。我们承认爱荷华大学核心设施的支持，包括中央显微镜，X射线晶体学和DNA核心。我们感谢爱荷华大学晶体学核心设施的Sankar Baruah和Lokesh Gakhar帮助动态光散射。作者宣称他们没有竞争的利益。 MNM，JLW和CMO写了这篇文章。 MNM和JLW对这份手稿作出了同样的贡献，因此是第一作者。所有作者审查了稿件并批准了最终版本。本文中描述的协议是从我们之前发表的作品（Madison等人，2014和2015; Welch等人，2017年）中改编的。

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