材料和试剂

微量离心管（1.5ml）（Sigma-Aldrich，目录号：Z336769）
铝箔
双面胶带
盖片，1.5-22×22mm（Sigma-Aldrich，目录号：Z692263）
显微镜幻灯片（AmScope，目录号：BS-50P）
Kimwipe（Sigma-Aldrich，目录号：Z188956）
移液器提示（康宁，目录号：4860）
微管蛋白（CYTOSKELETON，目录号：MT001-A）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G2025）
罗丹明微管蛋白（CYTOSKELETON，目录号：TL590M-A）
GTP（Sigma-Aldrich，目录号：G8877）
盐酸（HCl [37％，v/v]）（Sigma-Aldrich，目录号：320331）
从杆状病毒表达系统表达和纯化全长驱动蛋白运动蛋白
ATP（Sigma-Aldrich，目录号：A6419）
哌嗪-N，N'-双（2-乙磺酸）（PIPES）（Sigma-Aldrich，目录号：P6757）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M4880）
EGTA（Sigma-Aldrich，目录号：03777）
氢氧化钾（KOH）
紫杉醇（Sigma-Aldrich，目录号：T7402）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
DEAE-葡聚糖（Sigma-Aldrich，目录号：30461）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich：P5405）
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D0632）
蛋白酶抑制剂
抑肽酶（Sigma-Aldrich，目录号：A3428）
苄脒（Sigma-Aldrich，目录号：B6505或12072）
注意：产品"B6505"已停产。
消化抑素A（Sigma-Aldrich，目录号：P5318）
苯基甲磺酰氟（PMSF）（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
亮肽素（Sigma-Aldrich，目录号：L2884）
大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）（Sigma-Aldrich，目录号：T6522）
叔戊基甲基醚（TAME）（Sigma-Aldrich，目录号：283096）
过氧化氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：C1345）
葡萄糖氧化酶（Sigma-Aldrich，目录号：C6766或G7141）
注意：产品"C6766"已停产。
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：G7021或D9434）
10倍磷酸缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P5493）
BRB80（见配方）
1μM，10μM和100μM紫杉醇（参见食谱）
DEAE葡聚糖（参见食谱）
缓冲T（见配方）
防风（见食谱）

设备

Nichipet EX-Plus II移液管2-20μl（Nichiryo，目录号：00-NPLO2-20）
Nichipet EX-Plus II移液管10-100μl（Nichiryo，目录号：00-NPLO2-100）
水浴，从环境温度到100°C（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Precision ^{TM通用浴，目录号：TSGP02）}}
流动室（见程序）
倒置荧光显微镜（12伏100瓦卤钨灯，激发波长，547nm;发射波长，576nm，结合570nm分色镜，目标：CFI Plan Fluor 100x油）（Nikon Instruments，型号： Eclipse E600）

程序

荧光MT的聚合

在1.5ml微量离心管中，将0.25mg微管蛋白溶于60μlBRB80溶液（含有10％甘油）中。存放在冰上。
加入20微克罗丹明微管蛋白至60微升溶液。轻轻搅拌30秒，将管子半淹没在冰桶中。
将60μl微管蛋白混合物（价值10mM GTP）的总体积的1/10加入到60μl微管蛋白混合物中，终浓度为1mM GTP。反转轻轻混合。
加入混合物的混合物步骤1c的总体积的1/10，其值为1μM紫杉醇，最终的紫杉醇浓度为0.1μM。孵育（在水浴中）在37°C 10分钟
将混合物步骤1d的总体积的1/10加入到混合物中，最终紫杉醇浓度为1μM。孵育（在水浴中）在37°C 10分钟
将混合物步骤1e（价值100μM紫杉醇）的总体积的1/10加至混合物中，最终紫杉醇浓度为10μM。孵育（在水浴中）在37℃下10分钟。
将聚合的MT存放在室温下，将管覆盖在铝箔上并储存在衣柜中以保护混合物免受光照。 MT稳定使用长达两周。

准备室

图1.腔室输注使用两片双面胶带，将盖玻片连接到显微镜载玻片上，完成流动室的准备。使用适当体积的移液器，通过将溶液移液到流动室的开口中来注入腔室。使用Kimwipe来促进溶液在室内的扩散，并在最后吸收多余的液体

用HCl（37％，v/v）酸洗盖玻片24小时，用去离子水冲洗干燥24小时。
清洁后，将一滴0.2mg/ml DEAE-葡聚糖放在盖玻片上，放置5分钟。
用Kimwipe和空气干燥盖玻片吸收剩余液体。
在显微镜载玻片上放置两条双面胶带（长x 22毫米）彼此平行，距离彼此相距22毫米。将盖玻片向下放置，与胶带对齐，与面向显微镜载玻片的DEAE-葡聚糖涂层面对齐。参见图1。

准备捆扎混合物。

在缓冲液T中制备25μl混合物，用以下试剂至最终浓度; 2.5mM MT，0.2mM运动蛋白，10μM紫杉醇和1mM ATP。
注意：对于运动蛋白，我们使用流体力学测定（Tao等，2016）来确定MW。对于MT，我们使用MW微管蛋白二聚体（α微管蛋白+β微管蛋白）来计算MT的浓度。
在室温下以50rpm摇动混合物30分钟。

将步骤3的混合物浸入流动室中：

将25μl注入流动室，放置3分钟。参见图1.
用连续流动的25μl缓冲液T溶液（包括最终浓度为1mM ATP，10mM紫杉醇和Antifade的试剂）洗涤任何未松解的蛋白质，重复两次。使用类似的技术作为输液。参见图1.
使用倒置荧光显微镜（12伏100瓦钨卤化物灯，激发波长547nm;发射波长576nm，结合570nm二向色镜，目的：CFI Plan Fluor 100x油，Nikon）观察并记录MT束仪器，型号：Eclipse E600）。

数据分析

重复三次微管（MT）捆扎试验，三批试剂。每个实验收集15张图像。为确保一致性，建议重复三次测定，每次收集15张图像。图2显示驱动蛋白全酶将MT交联成束。图2A显示了由于驱动蛋白马达的交联活性引起的坚固束。然而，在图2B中，驱动蛋白-1头二聚体不捆扎MT，这表明电动机相对端的结合位点是交联所必需的，而不是两端在一端的作用。

图2.捆绑测定实施例当驱动蛋白-1头二聚体在相同条件下不能捆绑MT时，纯化的驱动蛋白全酶MT（A）的荧光显微镜检查（B）。刻度棒=10μm。（Tao等人，2016）

笔记

为了确保最大的捆绑活动，在捆绑测定中使用前，在30分钟内净化运动蛋白。
为了获得最佳效果，荧光微管应在其聚合两周内使用，将混合物储存在铝箔覆盖的容器中，保存在黑暗的位置。
将全长驱动蛋白马达cDNA克隆到具有6xHis标签的Gateway Baculovetic表达载体（pDEST8）中。经测序验证后，重组表达载体用于产生重组杆状病毒。收集杆状病毒感染的Sf9细胞，然后使用标准方案在Ni-NTA柱上纯化重组运动蛋白（Tao等人，2010）。

食谱

BRB80 *
80 mM PIPES
1mM MgCl 2
1 mM EGTA
用KOH调节pH至6.8
1μM，10μM和100μM紫杉醇
溶解在180μlDMSO中的20μl1mM紫杉醇=200μl100μM紫杉醇
6μl100微摩尔紫杉酚溶于54微升DMSO = 60微升10微克紫杉醇
6μl10μM紫杉醇溶于54μlDMSO =60μl1μM紫杉醇
DEAE葡聚糖
0.2mg/ml的ddH 2 O
缓冲区T *
20 mM Tris
150 mM KCl
2mM MgCl 2
1 mM DTT
用KOH调节pH至8.0 蛋白酶抑制剂，最终浓度为抑肽酶2μg/ml，Benzamidine20μg/ml，Pepstatin A1μg/ml，PMSF 0.1mM，亮肽素1μg/ml，SBTI100μg/ml，驯鹿40μg/ml，刚刚加入使用
防祸
10毫克过氧化氢酶
3 mg葡萄糖氧化酶
180毫克葡萄糖
100μl1 M DTT
1.90mg EGTA
100μl10x PBS
用ddH 2 O填充至1 ml

注意：列出的浓度是最终浓度，缓冲液是以ddH

致谢

这种MT捆绑测定的灵感来自于"Tum/RacGAP功能作为启动Pav/kinesin-6电机的开关"（陶瓷等，2016）和"有丝分裂马达的纯化和测定"（Tao和Scholey，2010年）。这项工作由NIH授予GM046409资助至W.S. NIH将GM 55507授予J.M.S.

参考文献

Tao，L.，Fasulo，B.，Warecki，B。和Sullivan，W。（2016）。 Tum/RacGAP用作激活Pav/kinesin-6电机的开关。 7：11182.
Tao，L.，Mogilner，A.，Civelekoglu-Scholey，G.，Wollman，R.，Evans，J.，Stahlberg，H.and Scholey，JM（2006）。< a class ="ke-insertfile" href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17141610"target ="_ blank">同源三聚体驱动蛋白-5，KLP61F，束状微管，并在动力测定中拮抗Ncd。 Curr Biol 16（23）：2293-2302。
Tao，L.and Scholey，JM（2010）。有丝分裂马达的纯化和测定。方法 51（2）：233-241。
van den Wildenberg，SM，Tao，L.，Kapitein，LC，Schmidt，CF，Scholey，JM和Peterman，EJ（2008）。< a class ="ke-insertfile"href ="http： ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19062285"target ="_ blank">同源四聚体驱动蛋白-5 KLP61F优先将微管交联成反向平行取向。 18（23）：1860 -1864。