材料和试剂

吸收垫（Bound Tree Medical，目录号：111-16650）
注射器和针头（BD，目录号：329461）
喷水壶（Qorpak，目录号：PLC-03431）
棉签（Uline，目录号：S18985PK）
两个29针，12 mm针电极，用于接地和参考（电极店，目录号：GRD-SAF）
小鼠
盐酸氯胺酮（NADA：045-290）/盐酸赛拉嗪（NADA：139-236）混合物（80mg/kg/13mg/kg）
1％硫酸阿托品眼科溶液（NDC：24208-750-60）
2.5％盐酸去氧肾上腺素眼科溶液（NDC：17478-200-12）
0.5％盐酸普拉卡因（NDC：24208-730-06）
保湿眼膏（Refresh Tears; Allergan，NDC：0023-0798）
2.5％羟丙甲纤维素（NDC：17238-610-15）
70％乙醇

设备

黑暗的房间
红色滤光片（ROSCO，目录号：Roscolux Supergel R27 Medium Red）
黑色电子胶带（3M，目录号：06132）
手术胶带（3M，目录号：15270）
Ganzfeld ColorDome（诊断，目录号：D125）或类似的
Espion视觉电生理系统（Diagnosys，目录编号：D315）或类似的
两台Bayer-Mittag隐形眼镜电极（西奈山，Phil Cook）（拜耳等人，2001）
镊子（精细科学工具，目录号：11295-00）
高架鼠标平台（泡沫或塑料可用于适应空间和尺寸要求）
非电加热垫（Braintree Scientific，目录号：DPIP）
清洁鼠标笼
可选：不透明盒（Rubbermaid商品，目录号：9S31），遮光布（Thorlabs，目录号：BK5），红光前照灯（普林斯顿Tec，型号：Sync头灯），红灯台灯（AstroGizmos，目录号：DSKLMP22 ），lux仪表（Fisher Scientific，目录号：06-662-63）

软件

数据分析软件如Microsoft Excel（v 14.7.1）或GraphPad Prism（7.0）

程序

注意：本协议应根据"机构动物保护和使用委员会条例"进行，并经机构许可。

实验前一天
1. 将小鼠放在防晒黑暗的房间里，让它们在夜间变暗。
2. 在37°C的浴室或孵化器中将非电热垫温热过夜。
进行实验
1. 设置黑暗的房间
2. 如果与过夜适应室不同，将小鼠移至实验室。这可以使用遮光布或防光盒来完成。未经测试的小鼠应保持在黑暗环境中。
3. 按如下所示设置刺激设置。
准备老鼠
注意：从这一点开始，只能使用红色滤光的光源，以保持老鼠适应黑暗。
1. 通过注射氯胺酮/盐酸赛拉嗪（80mg/kg/13mg/kg）麻醉小鼠，并使小鼠变得完全镇静（2-5分钟）。检查脚趾反应以确保动物充分麻醉。
2. 用1％阿托品硫酸盐，2.5％盐酸去氧肾上腺素和0.5％盐酸普拉卡因治疗双眼，允许滴在眼睛上静置约2分钟，然后用棉签吸干并应用下一滴。在这一点之后，眼睛应该用水合眼膏软膏保持水分直到接触透镜电极被施用（图1）。
  
  图1.硫酸阿托品麻醉小鼠，盐酸苯肾上腺素，盐酸普拉卡因和水合滴眼剂
3. 将鼠标放在加热的平台上。将接地针电极放置在尾部的基部，并将参考针电极细眼放置在眼睛之间（图2）。
  
  图2.鼠标上的电极放置
4. 从眼睛中吸收多余的水分，并向每只眼睛加入一小滴2.5％的羟丙甲纤维素。
5. 使用手指或镊子将隐形眼镜电极定位在角膜上。羟丙甲纤维素应保持镜片到位。使用手术胶带将电极线粘贴到垫可能有帮助，因此在实验过程中不会发生移位（图3，视频1）。
  
  图3.鼠标眼睛上的隐形眼镜电极
  
  Video 1. Applying the contact lens electrodes to the mouse eye
6. 将加热的平台滑入穹顶，使鼠标的眼睛在圆顶内（图4和图5）。
  
  图4.加热，升高的平台上的电极鼠标
  
  图5. Ganzfeld ColorDome 中的眼睛内的鼠标
7. 在开始之前和整个深色和深色测定中，定期检查阻抗水平是否可接受（在绿色范围内）。低阻抗电平表示电极已正确安装。
  注意：如果任何电极发生偏移，电路已损坏，阻抗可能较高。 Espion视觉电生理系统使用绿色，黄色和红色条显示阻抗，以表示电路中的电阻水平。
运行scotopic（暗适应）ERG
1. 记录暗疮ERG的设置
  
  步骤
  1
  2
  3
  4
  5
  6
  7
  8
  
  脉冲强度
  （cd sec/m ² ） 0.001
  0.002
  0.05
  0.1
  0.78
  1
  5
  10
2. 从以下设置开始
  5次试验/步骤
  脉冲频率：0.2 Hz 采样频率：1000 Hz 试用预触发时间：20 msec
  试用触发后时间：250毫秒
3. 使用Espion E2系统运行光强度的每个步骤。
  注意：每隔2-3个步骤或根据需要检查阻抗，以确保电极电路未损坏。
运行照片（光适应）ERG
1. 光以20 cd sec/m 2的光强度使小鼠适应至少10分钟。光适应使杆反应饱和，使得仅在小鼠眼中只有感光体群体的3％的锥体可以被刺激和记录而没有杆干扰（Fu，2010）。
  注意：如果动物开始醒来，可能需要给予老鼠第二次减少剂量的氯胺酮/赛拉嗪。
2. 记录显示ERG的设置
  
  步骤
  1
  2
  3
  4
  5
  6
  
  脉冲强度
  （cd sec/m ² ） 0.78
  1
  2.25
  5
  10
  20
3. 从以下设置开始：
  25次试验/步骤
  脉冲频率：1.0Hz 采样频率：1000 Hz 试用预触发时间：20 msec
  试用触发后时间：250毫秒
4. 使用Espion E2系统运行光强度的每个步骤。
实验后
1. 从鼠标中取出电极，用棉签和水轻轻地清洁接触电极。针电极可以用70％乙醇擦拭。
2. 将鼠标放在加热垫顶部的干净的笼子中，直至恢复。用保湿眼膏软膏保持鼠标的眼睛（图6）
  
  图6.鼠标在干净，加热的笼中恢复

数据分析

处理ERG数据（图7和8）
1. 来自两只眼睛的数据可以对于单个动物进行平均，或者单独分析，如果一只眼睛是实验的，另一只眼睛是对照的。
2. 使用数据分析软件（如Microsoft Excel或GraphPad Prism）生成跟踪。
3. 一波：
4. b波：
  1. b波幅度可以通过计算a波的底部和最高曲线的顶部之间的迹线幅度差来测量。
    注意：可能有振荡电位升高到b波曲线顶部以上。排除这些点，因为它们会给出不准确的b波。振荡电位被认为反映细胞在内部视网膜的活动，并且可以使用数字滤波器（Asi和Perlman，1992）进行分离。
  2. b波隐含时间（时间到峰值）可以通过计算a波的底部和b波的顶部之间的时间来测量。
    
    图7. C57BL/6J成年小鼠的代表性ERG踪迹。使用1cd sec/m 2的脉冲强度用于测量阴道ERG，并且脉冲强度5 cd sec/m ²用于测量明视ERG。
    
    图8.在ERG轨迹上定义a波和b波。通过计算时间（t）= 0和最小点之间的跟踪幅度差，测量a波跟踪。通过计算a波的底部和最高曲线的顶部之间的迹线幅度差来测量b波幅度。
ERG数据统计分析
1. a波和b波振幅：
  注意：所显示的a波和b波振幅的统计分析基于Vollrath等人的数据。（2015），并且可能不适用于每个数据集。
  1. 在每个实验组中编制单个光强度下的单一光强度的计算的a波振幅，并对Bonferroni的多重比较校正进行双因素ANOVA（图9）（Vollrath等，2015）。
  2. 对每个光强度重复统计分析。
  3. 以下符号可用于显示p值意义： **** P ≤0.0001， *** /em>≤0.001， ≤0.01，< em> * P ≤0.05（图9）。
    注意：我们建议每组使用至少5只动物达到统计学意义，但可能需要更多。
  4. 重复统计学分析，观察各向异性ERGS的b波振幅，光敏ERG的a波振幅以及明视ERG的b波振幅。
  5. 在一个或多个光强度下的a波幅度的显着差异可以指示两个实验组之间的感光器功能的差异。 b波幅度的显着差异可以指示感光器下游的视网膜细胞的功能差异，包括双极细胞（Vollrath等人，2015）。
2. a波和b波时间到峰值：

致谢

支持基金会失败盲人，BrightFocus基金会，Thome纪念基金会和NIH授予R01 EY025790和T32 EY20485的黄斑变性研究计划。
本协议应引用为Benchorin G.，Calton M.A.，Beaulieu M.O.，Vollrath D. Assessement of murine retinal function by eletroretinography。生物样品2017年。

参考文献

Asi，H.和Perlman，I。（1992）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1591967"target ="_ blank" >视网膜电图a波，b波和振荡电位之间的关系及其在临床诊断中的应用 Doc Ophthalmol 79（2）：125-139。
Bayer，AU，Cook，P.，Brodie，SE，Maag，KP and Mittag，T。（2001）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm.nih评估不同的记录参数，以建立啮齿动物中闪光视网膜电图的标准。 41（17）：2173-2185。
Brown，KT（1968）。视网膜电图：其组成部分及其起源。 Vision Res 。 8：633-677。
Creel，DJ（2015）。在：Kolb，HE，Nelson，R.，Fernandez，E.and Jones，B.（Eds。）。视网膜和视觉系统组织。
Duncan，JL，LaVail，MM，Yasumura，D.，Matthes，MT，Yang，H.，Trautmann，N.，Chappelow，AV，Feng，W.，Earp，HS，Matsushima，GK和Vollrath，D。（2003 ）。一个RCS样的视网膜营养不良表型在mer敲除小鼠。 Invest Ophthalmol Vis Sci 44（2）：826-838。
Fu，Y.（2010）。< 光杆和锥体中的光转导。：Kolb，HE，Nelson，R.，Fernandez，E.and Jones，B。（Eds。）。视网膜和视觉系统组织。
Perlman，I.（2015）。视网膜电图：Ido Perlman的ERG。在：Kolb，HE，Nelson，R.，Fernandez，E.and Jones，B.（Eds。）。视网膜与视觉系统组织。
Pepperberg，DR（2003）。漂白脱敏：背景和目前的挑战。 Vision Res 43（28）：3011-3019。
Phillips，MJ，Webb-Wood，S.，Faulkner，AE，Jabbar，SB，Biousse，V.，Newman，NJ，Do，VT，Boatright，JH，Wallace，DC and Pardue，MT（2010）在Ant1缺陷小鼠中，class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20671283"target ="_ blank">视网膜功能和结构。 em> Invest Ophthalmol Vis Sci 51（12）：6744-6752。
Vollrath，D.，Yasumura，D.，Benchorin，G.，Matthes，MT，Feng，W.，Nguyen，NM，Sedano，CD，Calton，MA和LaVail，MM（2015）。< a class = ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26656104"target ="_ blank"> Tyro3 调制Mertk 相关视网膜退化。 PLoS Genet 11（12）：e1005723。
Zhao，C.，Yasumura，D.，Li，X.，Matthes，M.，Lloyd，M.，Nielsen，G.，Ahern，K.，Snyder，M.，Bok，D.，Dunaief，JL，LaVail ，MM和Vollrath，D。（2011）。 mTOR介导的视网膜色素上皮的去分化引发小鼠中的光感受器变性。 J Clin Invest 121（1）：369-383。