材料和试剂

管子
15（VWR，目录号：525-0400）
50毫升（VWR，目录号：525-0402）
移液器提示
0.1-10μl（VWR，目录号：613-0735）
1-200μl（VWR，目录号：613-0740）
100-1,250μl（VWR，目录号：613-0739）
0.2μm过滤器（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
注射器，50ml（BD，目录号：300865）
蛋白质1（这里，NrdI，基因座标签：bc1353 ）和蛋白质2（这里，FNR1 > bc0385 ，FNR2bc4926 ，FNR3 < bc1495 ）
蛋白标记试剂盒RED-NHS（Amine Reactive）（NanoTemper）（含有NT-647-NHS染料[-20℃储存];用于缓冲液交换的离心柱[存储在4℃];用于纯化的重力流柱[在4℃下储存];标记缓冲液[在4℃下储存]）
MO-K002 Monolith TM NT.115标准处理毛细管（NanoTemper）（包含Monolith TM NT.115标准处理毛细管[RT]; 10％Tween 20 [在4℃];白蛋白部分A [在4℃下储存]; MST缓冲液（-20℃储存）;200μl小瓶）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D4540）
液体N 2
HEPES（AppliChem，目录号：A3724）
氯化钾（KCl）（EMD Millipore，目录号：104936）
Tween-20
缓冲液A（参见食谱）

设备

移液器（各种尺寸）
台式离心机
涡流
具有蓝/红滤光片的MonolithTM NT.115（NanoTemper Technologies，型号：MO-G008）

程序

用荧光染料标记蛋白质
1. 该步骤的说明基于使用由NanoTemper提供的染料和消耗品。 NanoTemper染料（即，RED，BLUE和GREEN）可用与例如赖氨酸的伯胺反应的NHS-酯基团或与例如上的巯基反应的马来酰亚胺基团。，半胱氨酸。也可以使用其它染料，或者使用具有荧光标签的蛋白质，在这种情况下不需要进一步标记。请注意，您选择的染料（或标签）必须与仪器中安装的过滤器兼容，并且一旦与蛋白质结合的染料不应阻挡任何潜在的结合位点。
  注意：当用荧光染料标记您的蛋白质之一时，您首先需要确定要标记的两种蛋白质中的哪一种。考虑到您只能使用非常少量的标记蛋白，这可能是有用的，根据K ，您可能需要使用更多的未标记蛋白质（至少20x K _D）。我们测量的结合亲和力在20-50μM范围内，为了具有令人满意的结合曲线，毛细管中的蛋白质浓度为约20nM的标记NrdI，毛细管1中的1mM FNR在毛细管16中具有1：1稀释系列。
2. 我们选择标记NrdI，因为我们正在测试其与三种其他蛋白质（FNR）的结合亲和力。 NrdI标有RED-NHS染料，因为它含有8个赖氨酸，没有半胱氨酸。基于NrdI晶体结构（Røhr等人，2010），我们不期望任何赖氨酸位于结合位点附近。
  注意：我们已经使用了缓冲区A（见配方）作为标签缓冲区。当使用基于NHS的染料时，蛋白质不应该在含有伯胺的缓冲液中，因为它们可能与标记反应中的蛋白质竞争。类似地，当使用马来酰亚胺类染料时，蛋白质不能在含巯基的缓冲液中。此外，还原剂DTT和β-巯基乙醇不应与任一染料一起使用（TCEP可用于两种染料）。如果蛋白质溶解在含有任何上述试剂的缓冲液中，则在标记之前需要缓冲液交换步骤。 NanoTemper在可能使用的标签套件中提供标签缓冲液，以及用于缓冲液交换的自旋柱。
  1. 使用标记缓冲液将蛋白质原料稀释至低于您预期的> D 的浓度。 NrdI稀释至25μM，最终体积为188μl 注意：NanoTemper建议使用2至20μM的蛋白质浓度和100μl的体积。
  2. 将染料溶解于100％DMSO（30μl）中。旋转良好，确保所有染料溶解
  3. 将染料溶解于100％DMSO（30μl）中。旋转良好，确保所有染料溶解
  4. 用标记缓冲液稀释染料，浓度为蛋白质浓度的2-3倍。在这里，将NT-647染料稀释至75μM，最终体积为188μl
  5. 以1:1体积比混合蛋白质和染料溶液，并在室温下在黑暗中孵育30分钟。
    注意：这是NanoTemper标签套件手册中描述的建议的反应条件，但改变染料：蛋白质比例或孵育时间可能会增加标签产量。
  6. 同时，洗涤试剂盒中提供的凝胶过滤柱。倒出储存溶液，并用3×3ml缓冲液A使用重力流平衡柱。
  7. 将蛋白质/染料混合物加入柱中树脂的中心。当样品完全进入柱床时，加入缓冲液以将应用样品的总体积调节至500μl（我们添加500-（2×188）=124μl缓冲液）。不要收集流经。
  8. 用600μl缓冲液A洗脱标记的蛋白质，并在干净的管中收集流动注意：也可以收集较小的级分（例如4×150μl）并检查每个级分的荧光强度，以便找到含有标记蛋白质的级分。请注意，免费染料可能会在最后洗脱。
  9. 进行毛细血管扫描（帽扫描）并检查标记蛋白的荧光强度。
    注意：还应确定标签的程度（见注释）。
  10. 将蛋白质等分成20μl级分，在液体N 2中快速冷冻并储存在-80℃。 4个月内使用荧光标记的NrdI蛋白
D - 测量
1. 将蛋白质原料转入15,000 x g，持续5分钟
2. 用缓冲液A稀释荧光标记的蛋白质，使荧光计数在200和1,500之间（仪器的检测限）。请记住，实际实验中蛋白质将以1:1稀释，并且您可能必须增加标记蛋白质的浓度以保持在检测限。荧光标记的NrdI蛋白以1:25稀释注意：您可以通过更改LED功率或荧光标记分子的浓度来调整计数。
3. 进行帽扫描以确保浓度在检测范围内，并且蛋白质不粘附到毛细管壁（粘贴由帽扫描轨迹中的肩峰或双峰证实，而不是平滑对称的曲线）（图1 ）。
  注意：如果蛋白质粘附到毛细血管上，您可能需要尝试添加去垢剂或添加剂，如Tween-20，BSA或Pluronic F-127，改变缓冲液的pH或离子强度，改为不同的缓冲液，或使用优质涂层毛细管。
  
  图1. 20％LED电源标准毛细管中1:25稀释度NrdI的Cap扫描
4. 16号微管1-16。
  注意：管上装有毛细管。
5. 吸管10-16缓冲液A在管2-16。
  注意：在步骤B5，B6和B7中使用10μl移液器可提高准确度。
6. 将20μl未标记的蛋白质吸管至管1中。取出10μl，并将其加入到管2中。通过上下移动多次混合。取出10μl，加入管3中。混匀。继续这样的所有管。在管16中，取出10μl，弃去液体。你现在应该在所有的管子里有10μl。
  注意：未标记的蛋白质也必须在测定缓冲液中以避免任何缓冲液稀释效应。您可能需要为每次传输使用新的移液器提示，以确保连续稀释时的体积一致。
7. 将10μl荧光标记的蛋白质加入所有管中，并充分混匀。每次使用新的吸头。
  注意：不要使用少于20μl的总体积的反应混合物，以便使粘附和蒸发问题最小化，并且减少移液误差。
8. 将反应混合物在室温下孵育5分钟
9. 将样品装入毛细管并将毛细管置于样品架中。
  注意：注意不要碰触中间的毛细血管，并避免毛细血管中间有任何气泡。
10. 将样品架置于MST仪器中。对所有毛细管进行帽扫描，并运行MST实验。使用20％LED功率和40％MST功率测量NrdI-FNR相互作用。
  注意：LED功率可以调整高达95％，而MST功率理想地不会增加到40％以上。

数据分析

检查原始数据
1. 评估上限扫描。它们应该是对称的，并且不应该在痕迹中表现出任何颠簸。每个峰的最大荧光强度不应大于±10％（图2）注意：如果荧光以浓度依赖的方式差异超过10％，则表明荧光在结合时发生变化，或标记的蛋白质在样品制备过程中由于沉淀或非特异性吸附而损失，其通过连续稀释进行。如果荧光以非浓度依赖的方式差异超过10％，则必须优化测定条件，如步骤B3所述。
  
  图2. Cap扫描检查 A.代表性实验的Cap扫描; B.在A.扫描中的荧光强度的变化
2. 检查MST-trace（图3）。任何颠簸表示样品不均匀。痕迹也不能互相交叉。
  
  图3.代表性实验的MST跟踪
  
  注意：热泳可以是阳性和阴性。我们已经观察到阳性热泳（见图3），即观察到的荧光的净减少，因为荧光标记的分子从毛细血管中较热的区域移动到较冷的区域。我们将每次运行结束时的MST跟踪的增加归因于对流（图3）。
数据处理与分析
使用MO.Affinity Analysis程序（NanoTemper）进行数据处理和分析。三或四个重复合并形成一个数据集。
1. 选择适当的绑定模型。我们选择了 K _D。
2. 输入荧光标记分子（TargetConc）的浓度，并通过勾选方框来解决这个问题。
3. 该程序将计算 K _D值和相关的不确定性。 NrdI-FNR的相互作用使用"热泳与T跳"评估策略进行分析注意：程序自动计算结合常数，同时考虑温度跳变（温度变化时荧光的立即变化）和热泳效应（分子在温度梯度中的移动）。这种模式称为带T跳的热泳。通过选择"专家模式"可以改变评估策略。在这种模式下，有四个选项可供选择：带T跳的热泳热泳T跳;和手动。在手动模式下，您可以手动定义要在分析中使用的前/后区域。不同模式的进一步解释和讨论可以在Scheuermann等人（2016）。
4. 检查绑定曲线。曲线的幅度应至少为5个响应单位，基线中的噪声应至少比振幅小3倍。
5. 为了比较几个数据集，可以通过在MO.Affinity Analysis程序中选择此选项来将每个数据集的荧光归一化为△ _norm。如图4所示，每个数据集的归一化荧光又可以除以结合曲线的幅度。我们将数据点和相关不确定度以及MO.Affinity分析程序中的拟合轨迹转移到原产地，其中△ _norm - 值除以结合曲线的幅度，并重新绘制曲线（图4）。
  
  图4.归一化荧光迹线（改编自Lofstad等人，2016）

笔记

结合常数可以从一种蛋白质制剂到另一种不同。
应进行的有价值的对照实验包括测试不同pH值和不同离子强度下的结合亲和力，并测试荧光标记的蛋白质与已知的非结合蛋白质或已知与蛋白质强烈结合的蛋白质标记的蛋白质（或两者）。
确定标签的程度（如FAQ中所述：如何确定标记后的蛋白质浓度和标记度（DOL）？[NanoTemper]）：

使用UV-vis分光光度计收集标记蛋白质的吸收光谱
读取280nm处的吸光度和染料的λmax 处的吸光度（根据所用的染料而变化）。
标记蛋白质的浓度可以使用以下公式找到：

其中，
d是分光光度计的路径长度，
ε是蛋白质的消光系数，
最大值是λmax最大值的吸光度，
考虑到染料在280nm处的吸收，CF是染料的校正因子标签的程度可以通过以下公式得到：

其中，
ε 是染料的消光系数

食谱

缓冲液A（50mM HEPES，100mM KCl，0.05％Tween-20） 1.192克HEPES
0.745克KCl
用Milli-Q蒸馏的H 2 O 2将其调至90ml，用KOH将pH调节至7.5，用Milli-Q蒸馏的H 2/> O。如有必要，再次调整pH值
使用注射器和0.22μm过滤器对溶液进行无菌过滤，并在4℃下储存直至使用（缓冲液已在5天内使用）
在实验前添加500μl10％吐温-20至终浓度为0.05％

致谢

该协议基于Monolith TM NT.115仪器（NanoTemper）和常见问题解答提供的用户手册：如何确定标记后的蛋白质浓度和标记度（DOL）？（NanoTemper）。这项工作由挪威研究理事会资助（项目231669和214239）。 MST仪器在挪威东南部地区卫生局（拨款2015095;结构生物学区域核心设施）的财政支持下运作。此协议的简要描述以前已在Lofstad等人公开。（2016）。

参考文献

Duhr S.和Braun D.（2006）。为什么分子沿着温度梯度移动。Proc Natl Acad Sci USA 103（52）：19678-19682。
Lofstad，M.，Gudim，I.，Hammerstad，M.，Rohr，A.K。和Hersleth，H.-P. （2016）。将Ib类核糖核苷酸还原酶活化为在蜡状芽孢杆菌中的黄素氧还蛋白还原酶。生物化学 55（36）：4998-5001。
Røhr，Å。 K.，Hersleth，H.-P.和Andersson，KK（2010）。跟踪黄素构象蛋白质晶体结构，具有拉曼光谱和QM/MM计算。 Angew Chem Int Ed Engl 49（13）：2324-2327。
Scheuermann，TH，Padrick，SB，Gardner，KH和Brautigam，CA（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26739938 "target ="_ blank">关于微量热泳法数据的获取和分析。 Anal Biochem 496：79-93。
Seidel，SA，Dijkman，PM，Lea，WA，van den Bogaart，G.，Jerabek-Willemsen，M.，Lazic，A.，Joseph，JS，Srinivasan，P.，Baaske，P.，Simeonov， Katritch，I.，Melo，FA，Ladbury，JE，Schreiber，G.，Watts，A.，Braun，D。和Duhr，S.（2013）。 Microscale thermophoresis量化在以前具有挑战性条件下的生物分子相互作用。 方法59（3）：301-315。