材料和试剂

盖板（22×22mm，No.1，厚度0.12-0.17mm）（Matsunami Glass，目录号：C022221）
注意：有人认为，为了维持细胞活力和成功长期观察活细胞，需要彻底清洁盖玻片的清洁步骤（Savoian，2015）。然而，如果使用这些盖玻片，除了在使用前使用70％乙醇的擦拭物，基本上不需要任何预处理。
塑料盖滑动夹（76 x 26毫米）
注意：文件夹是自定义的。长76宽32mm，厚1.7mm。有一个凹面（25毫米正方形），其中盖板滑落在表面上，在凹面中心有一个直径为15毫米的圆形孔）（见图1）。

图1.塑料盖滑盖。支架应置于显微镜平台上。有一个凹面，其中凹面（22×22mm）落在表面上，在凹面中心有一个直径为15mm的圆形孔。
10×10毫米开口框架，底部有粘合剂（Gene Frame 25μm）（Thermo Fisher Scientific Co.，Waltham，USA）
塑料培养皿（直径90mm）（AsOne，目录号：1-7484-01）
Kim-wipe（KCWW，Kimberly-Clark）
可以将bam-Gal4 :: vp16 （缩写为 bam-Gal4 ）用作用于睾丸特异性异位表达荧光蛋白的Gal4驱动子（Kitazawa等人，，2012）
UAS-dir2 被用作用于睾丸特异性消耗的Gal4驱动程序（Kitazawa等人，2014） br />
P {His2Av ^{T：Avic \ GFP-S65T} }（简写为Histone2Av-GFP）可用于表达与GFP标签融合的组蛋白2Av，以在活的减数分裂细胞中观察染色质（Bloomington Drosophila Stock Center，目录号：BL5941）
P（Ubi-mRFP-βTub85D）（简写为RFP-β微管蛋白）可用于与mRFP标签融合的β-微管蛋白的普遍表达，以显现活的减数分裂细胞中的微管（Kitazawa et al。 al ，2014）
可以将P {sqh-EYFP-Golgi} 用于与YFP标签融合的高尔基成分的普遍存在的表达，以在活的减数分裂细胞中显现高尔基体（Bloomington Drosophila Stock Center，目录号：BL7193） />
可以将P {sqh-EYFP-ER} 用于与YFP标签融合的ER成分的普遍表达，以显现活的减数分裂细胞中的内质网（Bloomington Drosophila Stock Center，目录号：BL7195） />
可以将P {sqh-EYFP-Mito} 用于与YFP标签融合的线粒体靶序列的普遍表达，以观察活的减数分裂细胞中的线粒体（Bloomington Drosophila Stock Center，目录号：BL7194） />
P 和 P {UASp-Venus-Orbit} 可用于轨道蛋白的可视化，必需的微管相关蛋白。可以诱导与三种不同荧光标记融合的轨道蛋白的UAS-库存（Miyauchi等人，2013）
（UASp-mRFP-Actin5C）（Bloomington Drosophila Stock Center，目录号：BL24777），P（UAS-GFP-Actin5C）（Bloomington Drosophila Stock Center，目录号：BL9257）和 P（UAS-CFP-Actin5C）（Miyauchi等人，2013）可用于与不同标签融合的F-肌动蛋白成分的异位表达在活体减数分裂细胞中观察F-肌动蛋白
（UAS-GFP-anillin）（Bloomington Drosophila Stock Center，目录号：BL51348）和P（Ub-mRFP-anillin）（Bloomington Drosophila Stock Center，目录号：BL52220）可用于生活在减数分裂细胞中的收缩环的可视化（来自布鲁明顿果蝇库中心的JA Brill的赠品）
p {w [+ mC] = sqh-GFP.RLC} 3可用于与GFP标签融合的肌球蛋白轻链组分的普遍表达，以在活体减数分裂细胞中显现MLC（来自R. Karess）
P（PTT-GA）Pdi [G00198]，一种蛋白质捕获物，表达GFP-蛋白质二硫键异构酶，用于细胞内膜结构的可视化（来自L.Cooley的礼物，现在可从布卢明顿果蝇库存中心获得目录号：BL6839）。表达GFP-LamC的蛋白质库，用于可视化核层（来自L. Wallrath的礼物）
用于可视化雄性减数分裂细胞（来自J.A.Billill的礼物）的P {UAS-PLCg-PH-GFP}
用于可视化的男性减数分裂细胞核膜中的核孔复合物的可见性（来自V. Doyle的礼物，现在可从Bloomington获得）的可视化的果蝇库中心目录号：BL35516）
使用P（UAS-GFP-Pav）和 P（UAS-GFP-Polo）可见微生物运动者和活的减数分裂细胞中重要的细胞分裂调节剂，分别（D.Glover的礼物）
对于雄性减数分裂细胞的RNAi实验，从VDRC股票中心和Bloomington股票中心获得了每种蛋白质的dsRNA异位表达的UAS-RNAi库。可以使用P（UAS-GFP RNAi）（Bloomington Drosophila Stock Center，目录号：BL9330）作为RNAi实验的阴性对照
秋水仙碱（BRB80缓冲液中为50μg/ml）（≥95％秋水仙碱）（Sigma-Aldrich，目录号：C9754）
注意：为了检查微管细胞动力学的需要，使用作为微管聚合抑制剂的秋水仙素。含有秋水仙素的BRB80缓冲液在每次解剖前制备。在含有秋水仙素的缓冲液中解剖睾丸，然后将减数分裂细胞铺在矿物油上。
细胞松弛素D（BRB80缓冲液中10μg/ml）（≥98％细胞松弛素D）（Sigma-Aldrich，目录号：C8273）
注意：为了检查细胞动力学中F-肌动蛋白的需要，使用作为肌动蛋白聚合抑制剂的细胞松弛素D。含有细胞松弛素D的BRB80缓冲液在每次解剖前制备。解剖雄性苍蝇以在含有细胞松弛素D的缓冲液中收集睾丸，然后将减数分裂细胞铺在矿物油上。
胎牛血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：451456或10437）
注意：胎牛血清可以在4℃保存一个月。}
矿物油（Trinity Biotech，目录号：400-5-1000）
注意：每次延时记录，矿物油被更换为新鲜的。
Brefeldin A（Cell Signaling，目录号：9972）或Exo1（Sigma-Aldrich，目录号：E8280）
注意：为了检查细胞动力学是否需要由COPI介导的膜转运，使用每种化合物抑制αCOPI。将它们直接加入到培养基中。每次清除前制备含有Brefeldin A或Exo1的BRB80缓冲液。睾丸可以在分离精母细胞之前在培养基中培养长达14小时。
PIPES（Dojindo Mecular Technologies，目录号：340-08255）
氯化镁六水合物（MgCl 2·6H 2 O）（Nacalai Tesque，目录号：20908-65）
乙二醇双（EGTA）（Nacalai Tesque，目录号：08907-42）
氯化钾（KCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：162-17942）
氯化钠（NaCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）<>>
M3培养基（Sigma-Aldrich，目录号：S8398）
BRB80缓冲液（pH 6.8）（参见食谱）
昆虫M3培养基（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）

设备

超细镊子（精细科学工具，型号：Dumont＃5）
解剖针锋利切割直径为0.5mm的钨丝
配备激发发射滤光轮（Olympus，Tokyo，Japan）的倒置荧光显微镜（Olympus，型号：IX81）
目标; UPLFLN40XPH（NA = 0.75），UPLSAPO60XO（NA = 1.4），UPLSAPO100XO（NA = 1.4）（Olympus，东京，日本）
汞块（Olympus，目录号：USH-1030L）
冷却CCD相机（滨松光子，型号：C10600-10B）
高压灭菌器

软件

Metamorph软件版本7.6（Molecular Devices，Sunnyvale，USA）

程序

为了用荧光标记感兴趣的细胞组分，可以诱导荧光标记的蛋白质，其由果蝇异位基因表达系统的每个靶组分组成，Gal4/UAS（Ashburner等人） >，2004; White-Cooper，2012）。或者，可以连续使用表达这种荧光蛋白的菌株。在前一种情况下，通过将具有荧光标签的蛋白质编码的cDNA的UAS原种杂交获得的F1后代置于UAS序列的控制下，可以用于延时观察（参见图2中遗传交叉的示意图）。在F1后代男性的睾丸细胞中，特异性诱导荧光蛋白的表达。 F1后代在28℃（不超过该温度）饲养，以诱导有效表达。对于耗尽实验，使用携带转基因以诱导每种靶蛋白的dsRNA的另一UAS原料代替上述UAS原料。在选择用于解剖的雄性蝇后，任何制备应在低于25℃的环境室温下进行。
注意：观察前应将显微镜台周围的室温调整至少25°C。

图2.遗传交叉产生产生荧光标记蛋白的F1后代以标记细胞内结构或表达dsRNA以消耗靶蛋白的F1后代。为了标记细胞内结构，诱导用于融合的cDNA的表达由GFP结构组成的蛋白质X，由GFP荧光标记进行，由Gal4/UAS系统进行。对于耗尽实验，诱导代表靶mRNA的一部分的dsRNA代替荧光蛋白X.
从室温下的上述成年人或新近成年的苍蝇（0-1日龄）仔细收集睾丸（图3）。要收集成人睾丸，上传到互联网网站的电影将作为指南（ https://www.youtube.com/watch?v=-ej8nF1YsRg ）。在解剖显微镜下将苍白腹侧面放置在塑料培养皿上的BRB80缓冲液中。使用一对镊子，他们的腹部被镊子夹紧，并将外生殖器轻轻拉向另一个相反的方向。在仔细地将相关附属组织远离一对睾丸后，如图3C所示分离出一对线圈睾丸。在秋水仙碱或细胞松弛素D处理的情况下，该解剖步骤分别在含有50μg/ml秋水仙碱和10μg/ml细胞松弛素D的BRB80缓冲液中进行。对于较长时间的治疗，从睾丸分离的精母细胞可以在含有10％胎牛血清和50％雄性细胞提取物的M3培养基中用药物孵育至14小时（Kitazawa等人，2012）。
注意：重要的是尽可能选择年轻的苍蝇，因为老年苍蝇中的睾丸含有较少数量的活精母细胞而不是大量的精子束。收集年轻苍蝇，将所有成年苍蝇从飞行培养管中弃去，丢弃后12小时至24小时收集新近放养的苍蝇。使用镊子轻轻快速地取出一副睾丸。建议您在三分钟内完成睾丸解剖（步骤1至4）。

图3.包括从正常男性成年人收集的一对睾丸的生殖道。A.野生型成年男性的腹侧视图。一个箭头表示外生殖器。比例尺= 1 mm。 B.从正常的成年男性收集的生殖道。男性生殖道由一对睾丸，精囊（sv）和附属腺（ag）组成。还附有射精管（ed）和射精球（eb）。比例尺= 1 mm。 C.从成年男性中分离出的一对睾丸，除去相关组织如精囊和附属腺体。注意，携带w突变的苍蝇具有无色睾丸，而野生型睾丸显示为淡黄色，如该照片所示。刻度棒=100μm。 D.一对睾丸的相构造显微照片。至少有一个或多个减数分裂囊肿由16个初级精母细胞组成，经过减数分裂I，距离睾丸顶端三分之一（箭头）。此时应进行解剖以撕开鞘。顶端（星号）。比例尺= 100μm。
将一个或两个睾丸转移和铺设在矿物油（Trinity Biotech，Bray，爱尔兰）上，将其装在干净的玻璃盖板上的开放室中（图4）。为了防止油滴在盖板上滑落，它被一个10 x 10 mm的开放框架包围，底部有粘合剂（Gene Frame 25μm，Thermo Fisher Scientific Co.，Waltham，USA）。应使用一串Kim-wipe仔细吸取额外的液体，以避免由于在延时记录期间残留在细胞下面的液体而导致睾丸细胞意外滑落（图3D）。 br /> 注意：如果可能，建议收集完整和健康的睾丸复合体，其中射精泵仍然积极收缩（图3B）。不应选择在解剖过程中穿刺的睾丸。

图4.使睾丸内的囊肿和细胞溅入矿物油中的程序示意图。 1.这里以较深的灰色示出的一半睾丸对直接位于一滴矿物油。一滴或两只睾丸可以在油滴中解剖。 2.使用一对钨针，覆盖睾丸的鞘从顶端（星号）撕开直到睾丸的三分之一。 3.用针头向外轻轻移动睾丸鞘，由16个初级精母细胞组成的囊肿可以扩散到油中。展开的细胞和囊肿以浅灰色表示。另一方面，每个囊肿应尽可能保持完好。从油滴中取出睾丸鞘。 4.使用一只连接在每只手的支架尖端的钨针，将覆盖睾丸的鞘撕开在顶端三分之一（图3D中的箭头）的位置，以便允许由16个初级精母细胞释放到睾丸外的油中，同时保持完整。油应随时覆盖每个睾丸细胞，以防止干涸。在这些条件下，完整囊肿内的细胞保持存活数小时（Kitazawa等人，2012; Savoian，2015）。

注意：少数种系干细胞位于睾丸顶端（Ueishi et al。，2009）。经历第一次减数分裂的16个细胞囊肿位于顶端的三分之一左右（图3C，3D和图4）。

图5.矿物油在减数分裂I早期的精母细胞活体16细胞囊肿的相差显微照片。已经开始减数分裂I的初级精母细胞由箭头指示。应选择这些细胞进行延时记录。（Inset）早期阶段主要精母细胞囊肿的premeiotic细胞。注意它具有较大的核仁（箭头）。完整的16细胞囊肿被黄线包围。 Bar = 10μm
放置在塑料盖滑盖上的盖板放置在倒置荧光显微镜（Olympus，Tokyo，Japan）上，配备激发发射滤光轮（Olympus，Tokyo，Japan）。使用40x干物镜或100x油浸透镜收集荧光信号。
由于果蝇精子细胞对光线极度敏感（Rebollo和Gonzalez，2004），延时成像的最关键点之一是尽可能限制照射到活细胞标本的剂量。因此，在显微镜平台上设置支架后，应该寻找前期I囊肿，其中成熟的精母细胞将在通过ND25过滤器的透射光下使用相差光学器件后不久开始减数分裂。在前期I细胞中，形成圆形多层核包膜，而在前一期的阶段观察到椭圆形细长的信封I.应当选择完整囊肿而不是单独停留的原代精母细胞进行成像尽可能的
时间推移图像的记录从GFP-微管蛋白的荧光开始积累在彼此相对的心轴极点（t = 0分钟）时的定时开始。或者，应该在相位对比（t = 0分钟）内核仁几乎消失的时间开始图像采集（图6）。
注意：建议您从最初的解剖步骤后十分钟内启动延时成像。

图6.在减数分裂前或开始时表达GFP-βTubulin的初级精母细胞的睾丸细胞的相差观察和荧光观察I。前期I的初级精母细胞或将启动减数分裂的细胞我很快应在透射光下通过相位对比观察发现，以避免长时间照射来自Hg灯的激发光。前期和前期的精母细胞表现出圆形细胞形态，而细胞延伸形成椭圆形形态，因为在前一期后减数分裂进展.5阶段（小箭头）的premeiotic精母细胞含有单个较大的核仁。随着减数分裂细胞周期的进展，核仁在S6期（箭头）变小并分解。包含微小的几乎看不见的核仁（箭头，A）的前期I的精母细胞也显示出在相对方向分离的主轴极上的GFP-微管蛋白的荧光强度变得剧烈（B）。星号（*）表示细长的精子细胞的捆扎尾巴。当相位对照（t = 0分钟）内的核仁消失时，图像采集可以从时间开始。在同时收集GFP-微管蛋白的荧光的情况下，记录应当在荧光在极点（t = 0分钟）变强时的时刻开始。比例尺= 10μm
在每30秒的时间间隔，感兴趣的细胞中的荧光标记的蛋白质被来自汞灯的照射光激发。使用适当的滤光轮组合通过GFP/RFP过滤器立方体，用UV过滤和快门光照亮样品。用CCD相机（Hamamatsu Photonics，Shizuoka，Japan）捕获近同时的GFP和/或RFP荧光图像。例如，可以进行荧光图像（10毫秒曝光）和相位图像（使用ND12滤光片的300毫秒曝光）的连续收集用于时间推移观察以检查初级精母细胞中细胞组分的动力学。图像采集通过Metamorph软件版本7.6（Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA）进行控制。
注意：可以调整焦点和显微镜平台，以便在查看计算机屏幕时使目标细胞组分清晰可见。
对于药物治疗，我们进行了初级精母细胞的短期体外培养（Rebollo和Gonzalez，2004; Kitazawa等人，2012）。

从成年男性收集附属于附属腺体，射精管和肛门的睾丸复合物。射精活动正在收缩的活睾丸复合体应选择并转移到M3培养基中。
对于与特异性药物如布雷菲德菌素A或Exo1进行更长时间的孵育，可将这些细胞内小泡运输抑制剂直接加入到由M3培养基组成的修饰培养基中，所述培养基不含有10％胎牛血清和50％雄性细胞提取物的碳酸氢盐根据（Kitazawa等人，2012），
将睾丸在培养基中孵育14小时，然后在室温下分离精母细胞。

注意：使用该方案，可以连续观察经历适当的染色体分离和细胞分裂的原代精母细胞至少一个小时而没有任何明显的异常（Kitazawa等，2012和2014; Hayashi等，2016）。延迟成像可以通过减数分裂I继续减数分裂II的终止，而无中等变化，尽管无介质置换的细胞的延长孵育可能由于代谢废物的额外积累而导致细胞毒性。

数据分析

该协议通常允许我们对具有良好重现性的减数分裂I的原代精母细胞中的染色体，微管，F-肌动蛋白，高尔基体，ER-结构和线粒体进行延时观察。携带转基因的精母细胞（试剂7,8,15,16）可诱导由细胞内结构组成的荧光标记蛋白的表达，用于延时实验。或者，由通过bam-Gal4原液（试剂5）和UAS原液（试剂12-14,17-19）之间的杂交产生的雄性制备精母细胞，以通过Gal4/UAS系统诱导荧光蛋白。
也可以同时记录从例如GFP-组蛋白2Av和RFP-β微管蛋白发射的具有不同波长的多个荧光。在前期I期间，在聚合RFP-β微管蛋白在主轴极（t = 0分钟）处变得不均匀时，在组装前均匀分布的染色质组装形成染色体。对应于两个主要常染色体，X-Y染色体和微小的第4染色体之间的二价体的GFP-组蛋白2Av的四个灶点应在前一期I（t = 15分钟）形成。由于与主要染色体重叠，通常不会观察到较小的第4染色体的二价体。
在前一期I，浓缩的二价染色体位于细胞核内，其中核膜似乎是完整的（t = 5分钟）。在前一期构建了从主轴极发出的星体微管。开发的微粒已经在核膜周围移动，达到相反的极点。然后，所有染色体互补物似乎在双极纺锤体结构的中心进入单个染色体质量，直到中期I（t = 55分钟）。每个染色体进行平均速度为11.2±1.2μm/min的极向运动，直到双相类动物连接（Savoian等人，2000）。虽然检测点在男性减数分裂方面比体细胞检测点不那么严格（Rebollo和Gonzalez，2000），但在主轴检查点进行微管装配状态调查。后期我花了约8分钟，染色体在染色体分离后以1.9±0.1μm/min的速度向前移动（Savoian等人，2000）。在这个阶段，主轴极周围的核膜已经分解，主轴微管自由伸长到核空间的内部。在后期I的开始，围绕核空间的多层核膜将包含粗细胞微管的纺锤体微管分开形成星形微管。两个中心主轴微管群体出现在二价体分离后（t = 60〜70分钟）。微管的外围组件变得更加动态，就像它们向细胞赤道寻找细胞质一样（Inoue等人，2004）。对应的微管束的另一组微管束位于细胞中部。来自相反极的周边微管在赤道处相遇，并形成向外突出的气泡状结构（t = 60分钟）。然后，内部和大部分外围中心心轴从每个极点释放，并在赤道处形成独立的束。然后在两极的外周微管接触细胞皮层之后立即观察到沟槽侵入。随着沟槽的进行，染色体脱水（t =〜80 min）。
根据上述程序和试剂（试剂9-11,16-18），还可以重复检查雄性减数分裂中高尔基体积，内质网结构，核包膜，质膜和线粒体的动力学（Inoue <等人，2012; Kitazawa等人，2012; Hayashi等人，2016）。也可以使用由上述库存产生的几种标记（试剂13-15）来显现F-肌动蛋白和其它包括收缩环在分裂沟部位的细胞骨架的分布。在细胞分裂中的微管动力学的调节蛋白的细胞定位可以在使用库存（试剂12和19）的活细胞细胞中检查，如Orbit，Pavarotti和Polo。微管相关蛋白过度表达的过度表达使稳定微管的轨道导致在特定频率（超过10％）产生异常纺锤体结构。动态的细节已经在其他地方描述（Inoue等人，2012; Kitazawa等人，2014）
在RNAi实验中，通过特异性在精子细胞中靶基因的dsRNA的异位表达，可以检查染色体，细胞骨架和其他细胞器的动力学是否会受到影响。在延期记录之前，应该测试UAS-RNAi库存是否可以扰乱染色体分离，细胞分裂或线粒体分布，这种分布在bam-Gal4驱动程序的存在下。可以通过在相差显微镜下观察减数分裂后的精母细胞进行调查（参见Kitazawa等人，2014年的补充表）。基于在使用不同UAS-RNAi种群的相同基因的多个RNAi实验中观察到的重叠表型的基础上，应该认为该基因在男性减数分裂中的作用。
在药物治疗中，将初级精母细胞在含有药物的夹层缓冲液中进行预处理。或者，延迟记录在药物存在下进行。应该考虑通过药物治疗在药物治疗的细胞中唯一观察到的异常作为细胞表型。应以取决于药物浓度的方式观察细胞表型。应该确认它们出现频率更高，并且随着浓度的增加，表型增强。

笔记

作为该方案的结果，可以以良好的再现性观察到如上所述的染色体和微管的动力学。如果检测到细胞退出细胞分裂或异常微管结构，则应停止延时记录并丢弃细胞，例如由于不适当的生理条件而出现的多极轴。 P（His2Av-GFP）以及P {His2Av-mRFP} 的纯合子产生异常精母细胞，减数分裂进展在中期以较低的频率被阻止超过10％）。

食谱

注意：上述每种试剂的缓冲液或培养基的成分和目录号如下。为了制备所有缓冲液，培养基和试剂，应使用通过诸如Sartorius arium等水净化系统制备的超纯水 。除非另有说明，缓冲液可以保持在室温。本协议中使用的任何材料均经过MTA。

BRB80缓冲液（pH6.8）
80 mM PIPES
1mM MgCl 2
1 mM EGTA
昆虫M3培养基
在无菌工作条件下的每次延时记录实验之前准备含有10％胎牛血清和50％雄性细胞提取物（Kitazawa等人，2012）的昆虫M3培养基
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）
137 mM NaCl
2.68 mM KCl
10.14mM Na 2 HPO 4
1.76mM KH PO 4
为了制成1L PBS，8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na 2 HPO 4和0.24g KH 2 N/> PO 4结合并溶解在H 2 O中，总体积为1L。将pH调节至7.4。缓冲液通过高压灭菌消毒。缓冲液可以在室温下储存

致谢

我们感谢萨维亚先生（马西大学，新西兰），分享关于实验程序的信息。我们承认V. Doyle（法国巴黎的Jacques Monod），L. Wallrani（美国爱荷华州爱荷华大学），D. Glover（剑桥大学，英国剑桥），L. Cooley（耶鲁大学，美国））和JA Brill（多伦多大学，加拿大多伦多）。我们还感谢维也纳果蝇RNAi中心，布卢明顿股票中心和果蝇遗传资源中心提供飞股。
没有可能影响其协议设计和实施的竞争或经济利益。这项工作得到日本科学促进会的部分支持[授予Y.H.I.的授权号26440188]。本协议经过我们以前的研究（Inoue等人，2004; Kitazawa等人，2012; Kitazawa等人）的改编或修改。，2014; Hayashi等人，2016）。

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