材料和试剂

无菌拭子
无菌细胞刮刀（IWAKI，目录号：9000-220）
无菌锥形管（50毫升和15毫升）
无菌培养皿（直径100毫米）
分光光度计的比色杯（1.5ml）（BOECO，目录号：BRA 759017）
Millex-GP过滤器单元（EMD Millipore，目录号：SLGP033RS）
无菌10ml注射器（Terumo，目录号：SS-10LZ）
Ultrafree MC滤波器（EMD Millipore，目录号：UFC30GV00）
无菌移液管（10ml）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：170356）}
L。嗜肺杆菌Lp01菌株（Philadelphia-1 rpslL hsdR ）（Berger和Isberg，1993）
cOmplete ^{TM蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：11697498001）}
氯化钠（NaCl）（Nacarai Tesque，目录号：31320-05）
12.5％预制聚丙烯酰胺凝胶（ATTO，目录号：e-PAGEL E-R12.5L;或等同物）
辉光排放的碳网格（Nisshin EM，目录号：649）
考马斯亮蓝（CBB）染色One（Nacarai Tesque，目录号：04543-51）
ACES（Sigma-Aldrich，目录号：A3594）
Bacto ^{TM酵母提取物（BD，Bacto ^{TM，目录号：212750）}}
MilliQ水
活性炭（Sigma-Aldrich，目录号：C5510）
Bacto ^{TM琼脂（BD，Bacto ^{TM，目录号：214010）}}
L-半胱氨酸盐酸盐一水合物（Nacarai Tesque，目录号：10313-55）
硝酸铁（III），水合铁（III），Fe（NO 3 3）3·9H 2 O（Nacarai Tesque，目录号：19514-55） br />
三羟甲基氨基甲烷（Tris）（Nacarai Tesque，目录号：35434-21）
盐酸（HCl）（Nacarai Tesque，目录号：18321-05）
蔗糖（Nacarai Tesque，目录号：30404-45）
苯甲基磺酰氟（PMSF）（Nacarai Tesque，目录号：27327-94）
异丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：190764）
EDTA·2Na（Nacarai Tesque，目录号：15130-95）
氢氧化钠（NaOH）（Nacarai Tesque，目录号：31511-05）
溶菌酶（Wako Pure Chemical Industries，目录号：120-02674）
Triton X-100（Nacarai Tesque，目录号：35501-15）
AG501-X8 Resin（Bio-Rad Laboratories，目录号：143-7425）
七水硫酸镁（MgSO 4·7H 2 O）（Nacarai Tesque，目录号：21003-75）
DNase I（Sigma-Aldrich，目录号：DN25）
氢氧化钾（KOH）（Nacarai Tesque，目录号：28616-45）
乙酸异丙酯（UA）（Merck，目录号：8473）
磷钨酸（PTA）（TAAB，目录号：p013）
CYE板（参见食谱）
AYE培养基（见食谱）
Tris-Cl溶液（pH 8.0）（参见食谱）
蔗糖溶液（参见食谱）
PMSF储备溶液（见配方）
EDTA储备溶液（参见食谱）
溶菌酶溶液（参见食谱）
Triton X-100储备溶液（见配方）
MgSO 4次要储备溶液（参见食谱）
DNase I储备溶液（参见食谱）
KOH溶液（参见食谱）
NaOH储液（参见食谱）
TET解决方案（请参阅食谱）
PTA解决方案（见配方）
乙酸溶液溶液（见食谱）

设备

玻璃瓶（2升）
37℃振荡培养箱
37℃培养箱
分光光度计
冷藏式离心机（KUBOTA，型号：7780;等效型号）
转子用于离心（KUBOTA，型号：AG-5006，AG-6512C）
无菌离心管（500 ml容量，聚丙烯或聚碳酸酯）
无菌离心管（容量为50ml，多聚体或聚碳酸酯）
清洁烧杯（200毫升）
磁力搅拌棒
磁力搅拌器
pH计
超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima< sup>> L-100 XP;或等效型号）
转子用于超速离心（Beckman Coulter，型号：70Ti型）
超速离心管（Beckman Coulter，目录号：355631）
Microfuge（Eppendorf，型号：5415 R）
玻璃烧杯（1升）
高压灭菌瓶（2升）
高压灭菌器
电泳仪（ATTO，型号：AE-6530;等效型号）
电子显微镜（JEOL，型号：JEM-1011）
ÄKTA净化器（GE Healthcare）
超级6 10/300 GL柱（GE Healthcare，目录号：17517201）

程序

长大嗜碱性杆菌Lp01菌株在木糖酵母提取物（CYE）板（Recipe No.1）上）从丙三醇冷冻原液中在37℃下培养3天。
使用无菌拭子连线。肺炎支原体菌落在CYE板的整个表面上，并在37℃下培养2天。
注意：需要用细菌草坪覆盖的两块板才能获得足够的起始材料，以制备1升培养物。
使用无菌细胞刮刀取全细菌，并用无菌管中的5 ml ACES缓冲酵母提取物（AYE）培养基（Recipe No.2）悬浮。测量OD 600 。将细菌溶液加入2L烧瓶中的1L AYE培养基中，使OD 600的悬浮液为0.2。
用旋转振荡（250rpm）在37℃下培养细菌12小时
在冰冷的水中冷却烧瓶。测量OD 600 。（应该是2.0-3.0，表明生长的延迟对数阶段）。将培养液转移到冷冻离心管（2-3管500ml容量）中。
在4℃（冷冻离心机：久保田，型号：7780或等效模型;转子：久保田，型号：AG-5006）以12,000xg（8,000rpm）离心收获细菌15分钟。
用含有1x cOmplete TM蛋白酶抑制剂混合物的140ml冷蔗糖溶液（配方4）重悬细菌沉淀。
注意：彻底悬浮细菌颗粒可提高步骤11中洗涤剂溶解的效率。
将悬浮液用冰块上的磁力搅拌棒将悬浮液转移到200毫升烧杯中
在室温下将烧杯放在磁力搅拌器上，轻轻搅拌直到达到均匀的悬浮液
按顺序添加PMSF（最终1mM，配方5号），EDTA（最终1mM，配方6号）和溶菌酶（最终0.1mg/ml，配方7号）。
注意：这是造粒过程。
准备20毫克/毫升200倍的储备溶液。将0.7ml该储备溶液加入到140ml蔗糖溶液中，在细菌悬浮液中产生约0.1mg/ml的最终溶菌酶浓度。在室温下继续搅拌30分钟。
在搅拌下逐渐加入7ml 20％（w/v）Triton X-100储备溶液（最终1％w/v，食谱8号）。
注意：这是细菌膜洗涤剂溶解最重要的一步。仔细监测颜色和粘度的变化。
继续搅拌直到溶液变得非常清洁（大约30分钟）。
加入420μl1M MgSO 4储备溶液（最终3mM，配方9号）和70μl10mg/ml DNase I储备溶液（最终5μg/ml，配方10号）。
注意：此步骤是消化DNA所必需的。
搅拌10分钟
加入EDTA（最终10 mM）
使用pH计监测pH值，通过加入1N NaOH调节pH至10.0（配方12号）注意：在此步骤中，残留的大膜囊泡和碎片被破坏。核心复合物在该高pH下是稳定的，而松散相关的污染蛋白质可以从核心复合物中分离出来。为了分析T4SS的松散相关成分，可以修改pH值以将这些蛋白质维持在复合物中。
将冰块放在冰上。

注意：以下程序应在4°C下进行。

将裂解液转移到冷冻的50 ml离心管中（分3管）
在4℃下以12,000×g离心裂解物20分钟以除去未裂解的物质。（冷冻离心机：久保田，型号：7780或等效型号;转子：久保田，型号：AG-6512C）。
恢复上清液并转移到超速离心管（Beckman Coulter）
在10℃下，在4℃下超速离心30分钟以沉淀蛋白质复合物。（超离心机：Beckman Coulter，型号：Optima L-100 XP或等效型号;转子：Beckman Coulter，型号：Type 70Ti）
丢弃上清液。用0.5ml冷TET溶液（配方13号）浸泡沉淀，包括每管1mM PMSF。要完全溶解，请在TET中将沉淀物在4℃下过夜。
合并完全溶解的悬浮液，并将其转移到新的锥形或离心管（总共〜5ml）中。使用额外的2-3毫升冷TET溶液，以完全从管中回收溶解的蛋白质，并将其合并到新的管中。
在4℃下以14,000×g离心悬浮液15分钟以除去沉淀物。（冷冻离心机：久保田，型号：7780或等效型号;转子：久保田，型号：AG-6512C）。
在4℃下将上清液以100,000xg的速度进行第二轮超速离心30分钟。（超离心机：Beckman Coulter，型号：Optima L-100 XP或等效型号;转子：Beckman Coulter，型号：Type 70Ti）
将沉淀重悬至〜300μl冷TET。样品准备进行生物化学和电子显微镜分析（图1A和1B）。
（可选）通过Superose进一步分离6用TET加50mM NaCl平衡的10/300柱色谱可用于去除由T4SS或污染蛋白质构成的大聚集体。收集级分并通过凝胶电泳和透射电子显微镜鉴定含有核心复合物的级分（如步骤28和29所示）（图1C和1D）。
注意：由于TET溶液含有干扰紫外线监测的Triton X-100，所以UV峰并不总是符合蛋白质复合物的存在。蔗糖密度梯度超速离心等替代方法可用于进一步纯化。
对于生化分析，应用12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）上的样品，并用现成的考马斯亮蓝染色溶液，CBB染色一（Nacarai）染色。
对于透射电子显微镜分析，将样品应用于辉光排放的碳网上，并用2％（w/v）PTA pH7.0（配方14号）或2％（w/v）乙酸二烷基酯（15号方案）。以80kV的加速电压拍摄显微照片。

数据分析

第二轮超速离心增强了分离的复合物的纯度，并且以下柱色谱法进一步消除了背景污染物（图1）。

图1.分离的Dot/Icm T4SS核心复合物的实施例A.分离复合物的SDS-PAGE分析比较第1轮和第2轮超速离心（分别为步骤21和25）。全细胞：全细胞裂解物（步骤20）; cfg1 ppt：第一超速离心沉淀（步骤22）; cfg2 ppt：第二超速离心沉淀（步骤26）。作为阴性对照，a。还缺少所有 dot/icm 基因（ΔT4SS）的肺炎支原体菌株分离程序（最右边的泳道）。 B.通过第二次超速离心获得的级分的电子显微照片; C.通过尺寸排阻柱色谱法（步骤27）获得的级分的SDS-PAGE分析; D.（C）的级分A10的电子显微镜照片。分子量标记以kDa表示。 MOMP：主要外膜蛋白。图像从Kubori等人改编而成。（2014）。

食谱

CYE板（24板，1升）
10克ACES
10克酵母提取物
在1升烧杯中溶解〜0.9L MilliQ水，通过加入1N KOH调节pH（参见配方11;〜40ml）并用pH计监测
使音量达到1 L
加入到含有磁力搅拌棒和2g活性炭和15g琼脂的2L耐高压灭菌烧瓶中搅拌即时混合
在121℃高压灭菌30分钟在室温下冷却直到温度达到〜60℃，轻轻搅拌。在此期间，将L-半胱氨酸（0.4克溶于10ml无菌MilliQ水中）和Fe（NO 3 3）3 N（0.135克）溶于10ml无菌MilliQ水）溶液在无菌15毫升锥形管中，并用10ml注射器
用Millex-GP过滤器过滤在搅拌下将L-半胱氨酸和Fe（NO 3 N 3）3种溶液（各10ml）加入到1L培养基中，继续搅拌5分钟，均匀混匀每道培养皿倒入40ml，冷却固化
AYE中（1L）
与CYE相同，除了省略了琼脂注意：AYE在准备当天不好用。为了取得良好的效果，AYE应该在军团菌文化的一天之前。旧媒体（准备后一周以上）不推荐。
Tris-Cl溶液（pH8.0）
1 M解决方案
用HCl调节pH至8.0 在121℃高压灭菌20分钟
蔗糖溶液
0.5 M蔗糖
150mM Tris-Cl（pH8.0）
PMSF库存解决方案
100 mM在异丙醇中 -20°C储存
EDTA储备溶液
0.5 M EDTA
用NaOH调节pH至8.0 在121℃高压灭菌20分钟
溶菌酶溶液
20毫克/毫升蔗糖溶液
准备在使用之前
Triton X-100储备溶液
含有〜2g AG501-X8用于去离子的树脂的20％（w/v）溶液
MgSO 4次要储备液
1 M解决方案
在121℃高压灭菌20分钟
DNase I库存解决方案
将粉末溶解在无菌水中，得到10mg/ml溶液 -20°C储存
KOH溶液
1 N解决方案
NaOH储备溶液
1 N解决方案
TET解决方案
10mM Tris-Cl（pH8.0）
1 mM EDTA
0.1％Triton X-100
PTA解决方案
2％（w/v）磷钨酸。调整至pH 7.0
乙酸铀溶液
2％（w/v）乙酸二铀酸盐
用0.22微米超滤MC滤波

致谢

这项工作得到MEXT/JSPS KAKENHI拨款15H01322（传统知识）的财政支持。本文介绍的协议已经从Kubori等人改编。（2014）。

参考文献

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