材料和试剂

0.22μm注射器过滤器，具有低蛋白质保留（Thermo Fischer Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：42204-PV）}
0.22μm真空过滤装置（Sartorius，目录号：180C7-E）
Superdex 200 10/300 GL预填充柱（GE Healthcare，目录号：17517501）
超级12 10/300 GL预填充柱（GE Healthcare，目录号：17-517-301）
20％EtOH-1L（Sigma-Aldrich，目录号：51976）
MilliQ水最小1 L
蛋白质标记：
甲状腺球蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：T9145）
Apo-Ferritin（Sigma-Aldrich，目录号：A3660）
β-淀粉酶（Sigma-Aldrich，目录号：A8781）
过氧化氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：C9322）
醛缩酶（Sigma-Aldrich，目录号：A2714）
醇脱氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：A8656）
白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A8531）
卵白蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：A5503）
碳酸酐酶（Sigma-Aldrich，目录号：C7025）
肌红蛋白（Sigma-Aldrich，目录号：M0630）
细胞色素c（Sigma-Aldrich，目录号：C7150）
凝胶过滤校准试剂盒具有优化的蛋白质范围也可商购：

蛋白质分子量凝胶过滤标记试剂盒29,000-700,000 Da（Sigma-Aldrich，目录号：MWGF1000）
蛋白质分子量凝胶过滤标记试剂盒12,000-200,000 Da（Sigma-Aldrich，目录号：MWGF200）
用于蛋白质分子量的凝胶过滤标记试剂盒6,500-66,000Da（Sigma-Aldrich，目录号：MWGF70）
凝胶过滤校准套件
高分子量（GE Healthcare，目录号：28-4038-42）
低分子量（GE Healthcare，目录号：28-4038-41）

氯化钙二水合物（CaCl 2·2H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：21097）
乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E4378）
氢氧化钠（NaOH）（Sigma-Aldrich，目录号：1.06462）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：H1758）
无水二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：D9779）
Trizma ^{®基质（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）}
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：31248或P9333）
注意：产品"31248"已经停产。
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
丙酮（Sigma-Aldrich，目录号：439126）
葡聚糖蓝（Sigma-Aldrich，目录号：D4772）
2 M CaCl 2（20 ml）（参见食谱）
0.1M EGTA（100ml，pH8）（参见食谱）
0.1 M DTT（见配方）
流动相（见食谱）

5mM Tris，150mM KCl，pH7.5（用于校准Superose 12色谱柱10/300GL）
5mM Tris，150mM KCl，5mM EGTA，1mM DTT pH7.5
5mM Tris，150mM KCl，5mM CaCl 2，1mM DTT pH7.5
50 mM HEPES，150 mM NaCl，0.1 mM DTT pH 7.5（用于校准Superdex 200 10/300 GL）

可用于流动相标记的总体积（见配方）
空隙体积标记（见配方）
蛋白质校准标准（见配方）
蛋白质样品（见食谱）

设备

ÄKTAFPLC系统（或类似的液相色谱系统，例如，ÄKTA纯，ÄKTA素加，ÄKTA启动），包括注射器，一个泵，紫外检测器，分馏收集器（GE Healthcare，型号：ÄKTA纯，ÄKTAprime plus，ÄKTA开始）
注意：ÄKTAFPLC已经停产，并用ÄKTApure替代。
样品环套件（GE Healthcare，目录号：18-0404-01）
汉密尔顿注射器（500μl）（Hamilton，目录号：81217或Sigma-Aldrich，目录号：S9266）
真空泵
台式离心机（Eppendorf，型号：5424 R）

软件

UNICORN ^TM 4.0ÄKTAFPLC色谱系统（GE Healthcare）的控制软件
Origin 8.0（OriginLab Corporation，Northampton，MA）

程序

以下协议通过在典型的FPLC系统中使用预包装的列来描述R> s的确定（图1）。缓冲液和其它溶液通过系统泵递送，并且样品可以以不同的方式（例如，通过注射器和样品环或通过样品泵）进行加载。检测系统（例如，UV/Vis吸光度，电导率）位于柱之后，以控制分离过程，并将蛋白质收集在馏分收集器中。尽管系统通常由软件控制，但是可以手动操作系统。特别是在ÄKTAFPLC中，分离运行的所有数据和参数都显示在UNICORN软件的系统控制模块中，这样可以控制色谱系统（例如，系统设置，运行数据，曲线）和在线监测分离过程。有关软件功能，请参阅UNICORN用户参考手册。

图1.典型的FPLC系统。 A.色谱系统的基本组分方案和典型流路方案; B. GE HealthcareÄKTAFPLC仪器的图片。

通过0.22μm过滤器过滤和去除所有溶液（MilliQ水，洗脱液，20％乙醇）
将FPLC系统的输入线从20％EtOH移至MilliQ水中。
注意：确保柱上的背压不超过制造商规定的最大压力值。
连接色谱柱（注射器出口 - 入口和出口检测器）（图2）注意：在将色谱柱连接到色谱系统之前，请确保阀门和管道中没有空气。确保色谱柱入口充满液体;将其连接到系统中，以一种即插即用的方式（拧下色谱柱的入口，让缓冲液流过系统并落到色谱柱入口处;然后拧下色谱柱的出口并连接到检测器）。

图2.色谱柱连接。 A.超级12 10/300 GL预填充柱与ÄKTAFPLC系统和仪器的一些重要组件连接的详细视图。，混合阀，注射阀，样品回路和检测器。 B.色谱柱出口的细节及其与检测器的连接。
长时间储存后使用色谱柱或首次平衡色谱柱如下：

以0.5ml/min的流速至少2倍体积的MilliQ水（2x柱体积）。色谱柱通常储存在20％乙醇中，产生高背压，因此初始流速不应超过最大推荐流速的一半。由于乙醇可能会导致流动相中使用的盐沉淀，因此建议在进行平衡之前将MilliQ水直至完全乙醇清除。
2x柱体积的流动相（洗脱液），流速为0.5-1ml/min。
注意：应选择洗脱液以确保样品溶解度充分。为了避免基质和溶质分子之间的任何不需要的离子相互作用，推荐使用离子强度等于或大于0.15M NaCl或KCl的缓冲液。制造商通常提供给定列的一些有用的洗脱剂组合物的列表。

将回路（100μl回路尺寸）连接到进样阀。用MilliQ水注射洗涤环（至少是循环体积的5倍）。用蛋白质洗脱液重复洗涤（根据使用的色谱柱）。
通过离心（10,000×g×15分钟）或通过0.22μm过滤器过滤样品，准备样品并从蛋白质溶液中除去颗粒物质。
样品通过具有两个位置，注入和注入的注射阀注入。当阀门处于负载状态时，环路可以填充样品（图3A，蓝色线），洗脱液被旁路到柱（图3A，绿线）。当阀门设置在注射器上时，洗脱液流过循环并将样品移动到柱（图3B，绿线）。

图3.注入阀在负载（A）和注射（B）位置中的示意图
通过加载蓝色葡聚糖（200-300μl，1-2 mg/ml溶于流动相，参见食谱）确定空隙体积。该浓度的蓝色葡聚糖将在峰值分数中在280nm（A <280）处获得0.5-1的吸光度。葡聚糖蓝也可用于控制柱填充。
注意：使用过量的样品来确保样品环完全填充（完全填充方法）。为达到最大循环体积的95％，需要大约2至3个循环体积的样品。注射前，请确保流量正确设定，并将进样阀设置为"加载"。将样品装入注射器（循环体积的2-3倍）并排出气泡。可能需要轻按注射器才能将气泡向上推。将注射器内容物轻轻注入循环。将注射器放在适当的位置，并将注射阀设置为"注入"。理想的体积载荷对应于总柱体积的1-2％之间的样品体积，以获得尖锐的峰值。另外，含有高蛋白质浓度（> 2mg/ml）的溶液可以导致粘度增加，从而降低溶质的扩散系数（Ricker和Sandoval，1996）。典型的流速为0.5-1ml/min，尽管通过减少在SEC实验中的流速，可以在给定的列上获得更高的分辨率（参见制造商对流速的建议）。
以5mg/ml（溶解在流动相中的0.63％v/v，见食谱）的200-300μl丙酮注入等分试样，以确定可用于流动相的总体积。丙酮可以在280nm检测
通过将选定的标准蛋白质溶解在0.5-1mg/ml的洗脱液缓冲液中（或制造商指示的浓度，参见食谱）来制备所选标准蛋白质的混合物。在应用于色谱柱之前检查蛋白质完全溶解，然后确定每个蛋白质标准品的V e。
注意：通常，五种蛋白质标准足以获得良好的校准图。在同一运行中可以使用多个标准（仅当不同标准的峰值完全解决时）。考虑到所选列的分馏范围，必须准确选择标准。
应用蛋白质样品（200-300μl，1 mg/ml）和未知的R</sub>，并确定相应的V e 。
注意：为了测定Ca ^{2 +}传感器蛋白质的Ca ^{2 +}依赖性变化，样品蛋白必须首先在不存在的情况下加载，然后在存在Ca ^{2 +}。 Apo条件包括pH7.5的5mM Tris，150mM KCl，1mM DTT和5mM EGTA，而Ca 2+饱和条件包括5mM Tris，150mM KCl，1mM DTT，和pH7.5的5mM CaCl 2。
如果色谱柱必须储存，用2x柱体积的MilliQ水洗涤，然后至少2x柱体积的20％乙醇洗涤。储存于4°C。
注意：对于列数据，现场清洗条件，色谱柱性能控制，缓冲液和耐溶剂性总是参考制造商的说明书。

数据分析

凝胶过滤的结果通常可视化为通过色谱柱洗脱的流动相的体积与检测器信号（对于蛋白质通常在280nm的信号）的曲线图，其被称为色谱图。通过计算从注射点到洗脱峰中心的洗脱液体积来确定给定分子的洗脱体积。
注意：色谱软件中的峰积分用于鉴定和测量曲线特征，如洗脱体积，峰面积和峰宽。特别是，在Unicorn软件4.0的评估模块中执行基本峰值集成：
选择Integrate：Peak Integrate菜单命令→选择源曲线→ 在"基准"列表中选择"计算基准"。积分色谱中的峰自动用洗脱体积标记。自动计算其他几个峰值特征。要显示其他特征，请从"选择峰表列"列表中选择要显示的选项。
表示可用于给定溶质物质扩散的固定相的分数的分布系数K d可以表示如下：

其中（另见图4），
V 是特定蛋白质的洗脱体积，
V 是柱的空隙体积，即，完全从珠的孔中排除的分子的洗脱体积，
基质中溶剂的体积等于固定相的体积。
在该方案中描述的方法中，通过测量丙酮的洗脱体积来确定V i，即，由具有（1）的小分子经历的最大保留体积获得可用于流动相的总体积，因为它将在移动和固定溶剂相之间自由分配）减去空隙体积V 0 。
然而，对于SEC中的分子量和/或R sub估计，广泛接受的是将项V 0替代为V 使用分区系数（K _av）：

其中，
V 3是填充床柱的总体积（图4），并且通过几何计算圆筒的体积（πr² h，其中r和h分别是柱的半径和长度，均以cm表示）。
V 表示可用于流动相的总体积和固体支持体积的总和，其不能溶于溶剂。由于固定相的估计体积（V sub-V o O）将包括凝胶形成物质的体积，因此K av不是真实的分布系数。然而，K av>>>>> to to>> and and and and>> 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4（（（）（Irvine，2001和GE Healthcare Handbook）。

图4.凝胶过滤柱参数。 A.V <0>，V 和V i 的示意图，，其被描绘为灰色区域。 B.凝胶过滤实验的理论色谱图，各种凝胶过滤参数的总结。
计算标准品的K ，并通过绘制K 相对于R s的对数获得校准曲线（对于R</sub>值见表1）。使用市售的凝胶过滤校准试剂盒获得的柱校准（Superdex 200 HR 10/300 GL预填充柱）的实例显示在图5中。校准曲线通过将K 值绘制每个标准对应于其对应的对数的10 值。应该获得基本上线性的关系。一旦为未知样本计算了K 值，则可以从校准图确定其R sub值。使用Origin 8.0（OriginLab Corporation，Northampton，MA）分析数据。
注意：绘制洗脱体积与标准蛋白质的Rs通常是足够的，通常产生大致线性的图。

图5. Superdex 200 HR 10/300 GL预填充柱（GE Healthcare）用于尺寸排阻色谱。标准蛋白的色谱分离和校准曲线。对于该凝胶过滤分析，流动相为50mM HEPES，150mM NaCl，0.1mM DTT pH7.5。 A.从两次运行（固体和虚线）的标准蛋白质获得的色谱图重叠。甲状腺球蛋白铁蛋白3β-淀粉酶;酒精脱氢酶;白蛋白牛血清;碳酸酐酶;细胞色素c。 B.通过绘制（A）中的每个标准与其对应的用于确定的对应的log 10的值的标准曲线准备的校准曲线蛋白质样品中的R 。校准数据来自（Astegno等人，2015）。

实践示例： Ca ²中的Ca ²依赖变化的确定+ - 传感器蛋白质CaM1来自拟南芥
使用SEC来确定来自拟南芥（AtCaM1）（AtCaM1）（Astegno等人）的CaM1的水合形状的Ca 2+ 2 +诱导的变化。 2016）。使用5mM Tris，150mM KCl，pH7.5作为流动相，用标准蛋白校准Superose 12 10/300 GL预填充柱（图6A）。然后在不存在和存在Ca 2+的情况下分别向流动相中加入5mM EGTA或5mM CaCl 2，分析AtCaM1的流体动力学行为，例子。存在和不存在Ca 2+的AtCaM1的色谱图叠加（图6B）表明当蛋白质在Ca中时，AtCaM1的V e e升高^{2 +} - 表格。然后使用校准曲线来评估AtCaM1的Ca 2+和无钙和Ca 2+的平衡状态的R sub，并且表明由于AtCaM1在Ca 2+上经历的大的构象变化的结果，向AtCaM1添加Ca ^{2 +}伴随着其R sub值的降低（图6C） sup> 2 + 绑定。在本研究中使用的浓度下，AtCaM1是载脂蛋白和Ca 2+/+ +/- 形式的单体。每个蛋白质样品至少有3个重复序列得到R</sub>值，并计算平均值±SD。

图6.来自拟南芥的apo和Ca ^{2 +} - 结合CaM1的R 的测定使用Superose 12色谱柱10/300GL测定AtCaM1的Ca ^{2 +} -free和Ca ^{2 +} - 状态之间的R < （GE Healthcare）。 A.从两次运行（固体和虚线）的标准蛋白质获得的色谱图重叠。白蛋白牛血清;卵清蛋白碳酸酐酶; 4.肌红蛋白细胞色素c。 B.在不存在（apo-AtCaM1）和Ca 2+的存在下（Ca ^{2 +} -AtCaM1）的AtCaM1的洗脱曲线。 C.通过绘制（A）中的每个标准对其相应的对数的10 值的K d d值的准备曲线。该图用于确定apo和Ca ^{2 +} - 条件下AtCAM1的R sub。在pH7.5时apo和Ca 2+的平均值分别为2.77±0.03nm和2.53±0.04nm，两种状态下的分子重量过高估计。此外，与AtCaM1结合的Ca ^{2 +}导致R sub（〜0.24nm）的降低。实验数据来自（Astegno等人，2016）。

笔记

色谱柱温度的不稳定性对分离和色谱柱效率的再现性产生不利影响。我们建议您将色谱柱保持在受控温度（通常为25°C）。
避免pH或其他可能导致蛋白质失活甚至沉淀的条件的极端变化。如果样品在SEC色谱柱中沉淀，色谱柱将被阻挡，可能不可逆转，样品可能会丢失。
SEC色谱柱不能干燥。确保长时间有足够的缓冲区。运行干燥的色谱柱必须重新包装。
混合溶剂时的气泡形成可能会导致FPLC分析中的许多问题（例如，假峰的出现，泵送可靠性的降低），这可以通过彻底脱气所有溶液来防止。

食谱

2 M CaCl 2（20ml）
将5.88g CaCl 2溶于20ml MilliQ水中
0.1M EGTA（100ml，pH8）
将3.8g的EGTA溶解在约20ml的MilliQ水中，用NaOH调至pH11，然后用HCl调至pH8.0。最后，加入MilliQ水至100 ml的最终体积
0.1 M DTT
将0.46g DTT（DL-二硫苏糖醇，无水）溶于25ml去离子水或蒸馏水中，调节体积至30ml，分配至等分试样，并储存于-20℃， >
移动阶段
流动相标记
以5mg/ml（0.63％v/v）溶于流动相中的丙酮。在加载柱子之前立即以10,000 x g离心15分钟
无效体积标记
通过在流动相中以1-2mg/ml溶解蓝色葡聚糖（平均MW 2,000,000Da）来制备溶液。在加载柱子之前立即以10,000 x g离心15分钟
蛋白质校准标准
在流动相中溶解每种蛋白质标准品，浓度为1-2 mg/ml或按照制造商的说明书规定，不要剧烈加热或混合。在加载柱子之前立即以10,000 x g离心15分钟
蛋白质样本
将流动相中的蛋白质样品溶解在1mg/ml（用于测定Ca 2+ /传感器蛋白的Rs中的Ca 2+ /依赖性变化），加入5mM EGTA或5mM CaCl 2 样品）

致谢

该议定书由Uversky先前发表的研究改编自1993年; Sorensen和Shea，1996; Astegno等，2016; Vallone等人，2016年。

参考文献

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