材料和试剂

注意：使用超纯水（通过净化去离子水制备，在25℃下达到18.2MΩcm的灵敏度）和分析级试剂来制备所有溶液。

胶原IV涂层板的制备
1. 移液器提示（Labcon，目录号：1030-260-000）
2. 96孔玻璃底板（IWAKI，目录号：12-017-006）
3. 氢氧化钠（NaOH）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：190-14565）
4. 磷酸缓冲盐（PBS）（Takara Bio，目录号：T900）
5. 盐酸（HCl）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：080-01066）
6. IV型胶原溶液（Life Laboratory Company，目录号：LL-10043）
7. 胶原蛋白溶液（见注1;参见食谱）
细胞培养
1. HeLa（人类宫颈癌）细胞（见注2）
2. 10厘米盘
3. MEM培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11095080）（参见注3）}
4. 胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：26140079）}
5. 胰蛋白酶-EDTA（Nacalai Tesque，目录号：32778-34）
用转染试剂管理质粒
1. 96孔U型底板（Corning，Falcon ^®，目录号：351177）
2. 金星标记的人类FLJ cDNA克隆质粒，其表达定位于某些核病灶的蛋白质（见附注4）
3. IT-LT1试剂（Mirus Bio，目录号：MIR2300）
4. Opti-MEM I减少血清培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：31985070）}
核糖核酸酶处理
1. 96孔板密封膜（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：12261012）}
2. 0.45μm过滤器
3. RiboShredder RNase Blend（Epicentre，目录号：RS12500）
4. 聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯（吐温20）（Nacalai Tesque，目录号：28353-85）
5. 2-氨基-2-羟甲基-1,3-丙二醇（Tris）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：011-20095）
6. 氯化镁（MgCl 2）（Nacalai Tesque，目录号：20909-55）
7. 乙二醇 - 双（2-氨基乙醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA）（Nacalai Tesque，目录号：08907-42）
8. 完全，不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
9. 多聚甲醛（PFA）（EMD Millipore，目录号：1.04005.1000）
10. DAPI（Sigma-Aldrich，目录号：D9542）
11. Pyronin Y（Sigma-Aldrich，目录号：P9172）
12. 1M Tris-HCl，pH 7.4（参见食谱）
13. 渗透缓冲液（见配方）
14. 4％PFA（见附注5;见配方）
15. DAPI解决方案（见配方）
16. Pyronin Y溶液（参见食谱）

设备

多通道移液器L8 x 200（Gilson，目录号：FA10011）
水浴（精细，目录号：FWB-21B）
离心机（KUBOTA，目录号：040-000）
血细胞计数器（SANSYO，SLGC，目录号：A103）
水库（BM设备，目录号：BM-0850-2）
二氧化碳（CO 2）培养箱（SANYO，目录号：MCO-18AIC UV）
配备有Plan Fluor ELWD 40x/0.6物镜（Nikon Instruments，型号：CFI Plan Fluor 40x）的IN Cell Analyzer 1000（GE Healthcare，型号：IN Cell Analyzer 1000）。使用DAPI（D360/40x）和金星（S475/20x）和DAPI（HQ460/40M）和金星（HD535/50M）的发射滤光片的激发滤光片。使用IN Cell Analyzer 1000软件（GE Healthcare，3.0版）
完成图像的采集和处理

软件

IN Cell Analyzer 1000软件（GE Healthcare，3.0版）

程序

胶原蛋白涂层板的制备
1. 用100μl0.2N NaOH在室温下清洗96孔玻璃底部微孔板的每个孔30分钟
2. 用100μlPBS冲洗每个孔，然后用100μl蒸馏水冲洗
3. 每个孔的玻璃底部用100μl胶原溶液在室温下涂覆1小时（见附注6）
4. 每孔用100μlPBS洗涤两次。
5. 通过移液从每个孔中完全清除PBS。板可以在4℃下储存1周。
细胞培养
1. 在37℃的水浴中解冻冷冻的细胞库，并通过低速离心（220×g，5分钟）回收细胞。通过移液去除上清液。
2. 轻轻重悬细胞沉淀在10ml生长培养基（例如，补充有10％FBS的MEM培养基）中，不含抗生素。
3. 在具有5％CO 2的湿润培养箱中培养生长培养基中的细胞，直至达到80％融合。
4. 对于质粒转染，在使用前1天将细胞种植在10厘米的培养皿中（见注释7）。
用转染试剂管理质粒
1. 种子6×10 3个细胞在转染前1天在胶原包被的96孔板的每个孔中的100μl生长培养基中。当细胞达到30-50％融合时，细胞应用于转染。
2. 将100ng金星标记的FLJ cDNA克隆质粒加入到96孔U底板的每个孔中的50μlOpti-MEM I还原培养基中。
3. 在单独的96孔U型底板的每个孔中加入0.3μlTrans IT-LT1试剂至50μlOpti-MEM I还原培养基。
4. 混合步骤C2和C3中制备的溶液，并在室温下孵育15-30分钟以形成质粒-TransIT-LT1复合物。
5. 将所得质粒-TransIT-LT1复合物（约100μl）直接加入到步骤C1中制备的96孔板的每个孔中的生长培养基中。
6. 在5％CO 2培养箱中培养细胞24小时（见附注8）。
核糖核酸酶处理
1. 用100μlPBS移液并清洗细胞一次，取出培养基
2. 用100μl透化缓冲液洗涤细胞一次，然后用100μl2％吐温20-透化缓冲液在室温下透化细胞10分钟（见注9）。
3. 用100μl透化缓冲液清洗细胞一次。
4. 用100μlPBS洗涤细胞一次，并在室温下用100μl50U/ml RiboShredder RNase Blend-PBS将RNA降解20分钟（参见附注10）。
5. 用100μlPBS洗涤细胞两次。
6. 将细胞用100μl4％PFA在室温下固定15分钟
7. 用100μlPBS洗涤细胞三次，每次5分钟。
8. 用100μlDAPI溶液染色DNA 1分钟
9. 用100μlPBS洗涤细胞三次。
10. （可选，见注11）用100μlPyronin Y溶液染色RNA 15秒
11. （可选）用100μlPBS洗涤细胞三次。
12. 向每个孔中加入100μlPBS，并用96孔板密封膜密封孔。
13. 使用IN Cell Analyzer 1000（图2）可视化金星信号并检测样品中的核灶。在400倍放大倍数下拍摄图像，自动优化曝光时间和硬件自动对焦。从每个井获得了25个不同领域的图像。（见注12）
  
  图2. NBs的RNase敏感性筛选的图像。通过用Pyronin Y染色观察细胞RNA，并通过监测耐RNase抗性Cajal体的持续性（由COIL-维纳斯）和RNase敏感性散斑虫（由SFPQ-Venus标记）的消失。 Sam68核体是新鉴定的RNase敏感型NB。箭头表示核病灶。 DNA用DAPI（蓝色）染色。 Bar =10μm。

数据分析

通过使用IN Cell Analyzer 1000软件计数作为核的概述的DAPI阳性椭圆形区域来确定细胞数目（n> 100）。手工计数核心阳性细胞数。核糖核酸酶敏感性通过核糖核酸酶处理的细胞中的核聚焦阳性细胞数相对于没有核糖核酸酶处理的细胞中的数目的比例来测量。

笔记

该解决方案应在使用时准备。
尽管这里描述的方案是用于HeLa细胞的，但是它可能适用于其他培养的细胞系（例如HCT116，U2OS和NIH3T3）。这些细胞系可以从几个细胞库中心获得，例如 American Type Culture Collection 。
培养基应适当选择使用的细胞系。
表达定位于某些核病灶的金星标记蛋白的FLJ克隆的列表可在以下网站获得： http://hgpd.lifesciencedb.jp/sys_info/download.html 。维纳斯标记的人类cDNA产物的定位图像可以在人类基因和蛋白质数据库（ HGPD）。原始的Gateway Entry克隆可从生物资源中心获得，国家技术与评估研究所（NBRC）。我们使用两种金星标记的蛋白作为对照：SFPQ-Venus（一种斑马鱼的标记，RNase敏感性NB）和COIL-Venus（Cajal体的标记，RNase抗性NB）。
该解决方案应在使用时准备。
可以根据所使用的细胞选择其它涂层试剂如阳离子聚合物（例如，聚-L-赖氨酸）或基质蛋白（例如，层粘连蛋白，纤连蛋白）。
细胞通道数应少于5个。
应通过改变IT-LT1试剂的浓度来优化转染条件。
通过监测对照金星标记蛋白（注4）和Pyronin Y染色，应优化渗透条件。应对每种使用的细胞系优化吐温20的浓度。应该注意的是，用较高浓度吐温20的治疗常常导致金星信号在细胞中的消失
应通过监测对照金星标记蛋白（注4）和Pyronin Y染色优化RNA酶条件。我们总是比较两种具有和不具有RNase处理的样品用于一个cDNA克隆。
通过用Pyronin Y染色细胞RNA来确认RNA酶处理的效果。
为了对所选cDNA产物的定位位点的最终判断，应确认N-末端和C-末端金星标记的蛋白质，以一致地定位在相同的NB中。此外，相应内源蛋白的定位应通过用特异性抗体标记来确认

食谱

胶原蛋白溶液
在0.05N HCl中稀释8.6μl/ml胶原蛋白
1M Tris-HCl，pH 7.4（1L）
用超纯水稀释121.1克Tris，用盐酸调节pH至7.4
渗透缓冲液
20mM Tris-HCl，pH 7.4
5mM MgCl 2
0.5 mM EGTA
1x完全无EDTA蛋白酶抑制剂鸡尾酒
4％PFA
向PBS中加入0.4 g PFA，并将体积调整为10 ml
在55℃下剧烈振荡，直到完全溶解，并通过0.45μm过滤器滤出
DAPI解决方案
加入10毫克DAPI超纯水，调节体积为1毫升（10毫克/毫升DAPI原料）
储存于-20°C
使用前，稀释1μl10 mg/ml DAPI原液在10ml PBS（1μg/ml DAPI）中
Pyronin Y解决方案
加入3mg Pyronin Y超纯水，调节体积至10ml（1mM Pyronin Y库存）
储存于-20°C
使用前，用PBS（1μMPyronin Y）稀释1000倍

致谢

这个协议是从我们最近出版的作品（Mannen等人，2016年）改编而成。我们感谢国立先进工业科学技术研究所的Goshima，Kawamura和H. Mochizuki在制备金星标记的cDNA文库方面的支持。这项研究得到了日本教育，文化，体育，科学和技术部赠款的支持（26113002和26291001）。

参考文献

Audas，TE，Jacob，MD和Lee，S。（2012）。通过核糖体间质非编码RNA固定核仁中的蛋白质。细胞 45（2）：147-157。
Biamonti，G.和Vourc'h，C.（2010）。 Cold Spring Harb Perspect Biol 2（6）：a000695。
Chen，LL and Carmichael，GG（2009）。已更改在人胚胎干细胞中含有反向重复的mRNA的核保留：核非编码RNA的功能作用。细胞 35（4）：467-478。
Chujo，T.，Yamazaki，T。和Hirose，T。（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26021608" target ="_ blank">建筑RNA（arcRNA）：一类用作核体的支架的长非编码RNA。 Biochim Biophys Acta 1859（1）：139-146。
Clemson，CM，Hutchinson，JN，Sara，SA，Ensminger，AW，Fox，AH，Chess，A.and Lawrence，JB（2009）。核非编码RNA的构建角色：NEAT1 RNA对于散斑结构是必不可少的。 em> 33（6）：717-726。
Fox，AH，Bond，CS and Lamond，AI（2005）。分子生物细胞 16（11）：5304-5315。
Fox，AH，Lam，YW，Leung，AK，Lyon，CE，Andersen，J.，Mann，M.and Lamond，AI（2002）。 Paraspeckles：一个新颖的核域。 Curr Biol 12（1）：13-25。
分子生物细胞 16（11）：5304-5315。
Fox，AH，Lam，YW，Leung，AK，Lyon，CE，Andersen，J.，Mann，M.and Lamond，AI（2002）。 Hirose，T.和Goshima，N。（2015）。使用荧光标记的FLJ cDNA克隆文库的核体成分的基因组共定位筛选。方法Mol Biol 1262：155-163。
Mannen，T.，Yamashita，S.，Tomita，K.，Goshima，N。和Hirose，T。（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/27377249"target ="_ blank"> Sam68核体由两个由适配器HNRNPL连接的核糖核酸酶敏感亚结构组成。细胞生物 214 1）：45-59。
毛泽东，YS，Zhang，B.和Spector，DL（2011）。核体的生物发生和功能。 趋势基因 27（8）：295-306。
Naganuma，T.，Nakagawa，S.，Tanigawa，A.，Sasaki，YF，Goshima，N。和Hirose，T。（2012）。< a class ="ke-insertfile"href ="https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22960638"target ="_ blank">长非编码RNA的替代3'末端处理启动构建核paras。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。 20）：4020-4034。
Praserh，KV，Prasanth，SG，Xuan，Z.，Hearn，S.，Freier，SM，Bennett，CF，Zhang，MQ and Spector，DL（2005）。通过RNA核保留调节基因表达。 Cell 123（2）： 249-263。
Sasaki，YT，Ideue，T.，Sano，M.，Mituyama，T.and Hirose，T。（2009）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi.nlm .nih.gov/pubmed/19188602"target ="_ blank"> MENepsilon /β非编码RNA对于核散斑的结构完整性至关重要。 Proc Natl Acad Sci USA 106（8）： 2525-2530。
Sleeman，JE和Trinkle-Mulcahy，L.（2014）。。Curr Opin Cell Biol 28：76-83。
Sunwoo，H.，Dinger，ME，Wilusz，JE，Amaral，PP，Mattick，JS and Spector，DL（2009）。< a class ="ke-insertfile"href ="http：//www.ncbi。 nlm.nih.gov/pubmed/19106332"target ="_ blank">MENε/β核保留的非编码RNA在肌肉分化时被上调，并且是paraspeckle的重要组成部分。 19（3）：347-359。