材料和试剂

血清移液管
移液器提示（STARLAB INTERNATION）
塑料铲
50ml管（SARSTEDT，目录号：62.547.254）
15 ml管（SARSTEDT，目录号：62.554.002）
（Eppendorf，目录号：0030119401）
1.5毫升管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
0.5ml管（SARSTEDT，目录号：72.699）
Steritop0.22μm过滤器（EMD Millipore，目录号：SCGPT01RE）
Amicon Ultra-15集中器50 kDa截止（EMD Millipore，目录号：UFC905024）
塑料柱（例如，空的PD-10柱）（GE Healthcare，目录号：17043501）
PD-10脱盐柱（GE Healthcare，目录号：17085101）
Amicon Ultra-4集中器50 kDa截止（EMD Millipore，目录号：UFC805024）
MRC 96孔2滴结晶板（分子尺寸，目录号：MD11-00-100）
Ni ^{2 +} -NTA超流5ml预填充柱（QIAGEN，目录号：30760）
Superdex 200 GL 10/300凝胶过滤柱（GE Healthcare，目录号：17517501）
昆虫细胞系（表达系统，目录号：94-002F）
Trichoplusia ni
pBacPAK8质粒（Takara Bio，Clontech，目录号：PT1262-5）
flashBAC ULTRA DNA（Oxford Expression Technologies，目录号：100300）
ESF921昆虫细胞培养基（Expression Systems，目录号：96-001-01）
胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：F9665）
cOmplete，无EDTA的蛋白酶抑制剂片剂（Roche Diagnostics，目录号：11873580001）
PMSF（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）
液氮
NECA（Sigma-Aldrich，目录号：E2387）
咪唑（Sigma-Aldrich，目录号：56748）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：10598630）
N-癸基β-麦芽糖苷（DM）洗涤剂（Anatrace，目录号：D322）
TEV蛋白酶（内部生产）
Ni ^{2 +} -NTA琼脂糖（QIAGEN，目录号：30210）
氯化镁（MgCl 2）（Fisher Scientific，目录号：BP214-500）
Apyrase（Sigma-Aldrich，目录号：A6535）
乙酸钠（Fisher Scientific，目录号：10794761）
MemGold ^TM结晶屏幕（分子尺寸，目录号：MD1-39）
PEG 2000（Sigma-Aldrich，目录号：81221）
注意：本产品已停产。
PEG 2000 MME（Sigma-Aldrich，目录号：81321）
注意：本产品已停产。
PEG 400（Hampton Research，目录号：HR2-603）
甘油（VWR，目录号：24388.320）
HEPES（Sigma-Aldrich，目录号：H3375）
EDTA
绝对乙醇（VWR，目录号：20821.330）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D2650）
正辛基-β-D-硫代葡糖苷（OTG）洗涤剂（Glycon，目录号：D20014）
Precision Plus SDS-PAGE分子量标准（Bio-Rad Laboratories，目录号：161-0373）
4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE凝胶（Fisher Scientific，目录号：EC60255BOX）
缓冲液A（参见食谱）
PMSF储备溶液（见配方）
NECA库存解决方案（见配方）
DM储备溶液（参见食谱）
缓冲液B（参见食谱）
缓冲区C（见配方）
缓冲区D（见配方）
缓冲液E（参见食谱）
OTG储备溶液（见配方）
Apyrase储备溶液（见配方）
缓冲区F（见配方）

设备

移液器（STARLAB INTERNATION）
最佳生长^{TM 5L烧瓶（Thompson Instrument Company，目录号：931116）}
Shaker孵化器（Infors，型号：Multitron Standard）
高速离心机（例如，Beckman Coulter，型号：Avanti J-26XP，目录号：393124）
45型Ti（Ti45）超速离心机转子（Beckman Coulter，目录号：339160）
45型Ti（Ti45）超离心瓶组件（Beckman Coulter，目录号：355622）
水浴（Julabo）
ULTRA-TURRAX T25均质机（IKA，型号：ULTRA-TURRAX T25均质器）
磁力搅拌棒
70型Ti（Ti70）超离心转子（Beckman Coulter，目录号：337922）
70型Ti（Ti70）超离心瓶组件（Beckman Coulter，目录号：355618）
蠕动泵（例如，GE Healthcare，型号：Pump P-1，目录号：18-1110-91）
冷藏式台式离心机（例如，Eppendorf，目录号：5430R）
辊式搅拌机（IKA，型号：ROLLER 6数码，目录号：0004011000）
TLA55台式超速离心机转子（Beckman Coulter，目录号：366725）
Optima L100 XP制备型超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima ^TM L-100 XP）
Optima MAX台式超速离心机（Beckman Coulter，型号：Optima ^TM MAX）
冷冻微量离心机（例如，Eppendorf，目录号：5418R）
转子能够旋转1升瓶（例如，JLA-8.1000）（Beckman Coulter，目录号：363688）
ÄKTA净化器色谱系统（GE Healthcare，型号：ÄKTA净化器）
Mosquito ^®晶体蛋白结晶机器人（TTP Labtech，型号：mosquito Crystal）

软件

UNICORN（GE Healthcare）
图形软件（例如，，Prism 7）（GraphPad）

程序

A 2A细胞在昆虫细胞中的表达
截短以去除柔性C末端（见注1）并含有N154A突变以除去潜在的N末端糖基化位点的人A 2A'R是克隆到转移载体pBacPAK8中，并按照制造商的说明书使用flashBAC ULTRA系统制备杆状病毒。 A 2A R构建体含有C末端10x组氨酸标签以促进纯化（参见附注2）和TEV蛋白酶切割位点以允许去除组氨酸标签（图1）。

图1：2A亚型R杆状病毒表达构建体。使用Bam 将2A亚基R克隆到杆状病毒转移载体pBacPAK8中> HI和不是 I限制性位点（下划线），并且使用flashBAC ULTRA系统制备杆状病毒。该构建体由人A 2A亚基残基1-308，然后是TEV蛋白酶切割位点（以绿色突出显示）和C末端10x组氨酸标签（以红色突出显示）组成。 2A R含有N154A突变（以黄色突出显示）以除去潜在的N末端糖基化位点。开始和结束密码以粗体显示。
1. 稀释T （在ESF921无血清培养基中生长）以5×10 6细胞/ml的密度在5L最佳生长烧瓶中加入2,730ml，并在27℃下孵育过夜C，以124rpm振荡
2. 一旦密度达到3.3×10 6细胞/ml，加入150ml胎牛血清（终浓度为5％v/v）和120ml第3代A 2A R杆状病毒（终浓度为4％v/v）
3. 在27℃孵育65-72小时，以124rpm摇动。
4. 通过在4℃下以5,000×g离心10分钟来收获细胞。
5. 将细胞沉淀重悬于缓冲液A中的最终体积为180ml，加入4种蛋白酶抑制剂片剂和PMSF，得到终浓度为1mM。闪光在液氮中冷冻并储存在-80°C
昆虫细胞膜制备
进行粗制膜，其保留所有不溶性细胞内成分，同时除去可溶性蛋白质。这种类型的膜制备有助于限制膜片段的损失并最大化2A 2A的回收。该方案描述了来自三升昆虫细胞培养物的膜制备，其对于一个2AR2R纯化是足够的。然而，如果需要，可以使用单个Ti45超速离心机转子同时处理两批（总共六升培养物）。
1. 在室温下在水浴中从3L昆虫细胞培养物中解冻细胞沉淀
2. 添加新鲜的PMSF以使终浓度为1mM，将溶液转移到三个Ti45管中，并在Ti45转子中以158,000×g（45,000rpm）在4℃下离心2小时。确保管子正确填充（颈部），如有必要，补充缓冲液A. （见注3）
3. 小心地除去上清液，直到与血清学移液管的颗粒顶部水平一致（见图2）
  
  图2.超离心后膜片的图示超速离心后，膜片颗粒的表面上观察到含有大量A 2A R的扩散层。重要的是不要倾析上清液，因为这将去除扩散层，导致A 2A R R的产率降低。相反，应使用血清移液管小心吸取上清液，直至与膜片的顶部水平（用虚线表示）。
4. 向每个管中加入25毫升缓冲液A，并使用塑料刮刀将颗粒破碎成小块
5. 使用以10,000rpm运行的ULTRA-TURRAX T25均质器均质沉淀，直至不残留块状物。每管约需30秒。
6. 用缓冲液A加热管，并在4℃下在Ti45转子中以158,000 x g（45,000rpm）离心2小时。（见注3）
7. 用血清移液管取出上清液直至与沉淀物顶部平齐（见图2）
8. 使用塑料刮刀，然后用ULTRA-TURRAX T25匀浆器将剩余的缓冲液重悬于管中。不要超过160毫升的终体积。将膜悬浮液等分成50ml管，在液氮中闪蒸冷冻，并储存在-80℃。膜可以在这些条件下储存长达三个月。
A 2A R的纯化在激动剂NECA的存在下，在癸基麦芽糖苷（DM）中纯化A 2A'R，使用从先前描述的用于纯化热稳定的A 2AA的方法， R建筑（Lebon等人，2011a和2011b; Tate和Lebon，2015）。如果将复合物稍后更换成用于蒸气扩散结晶的短链洗涤剂，则必须使用DM。该方案通常产生3-6mg来自3L昆虫细胞培养物的纯A 2AA R。
1. 在室温下在水浴中从3L昆虫细胞培养物中解冻膜。
2. 加入4种蛋白酶抑制剂片剂，NECA（100μM），咪唑（10mM），PMSF（1mM）和NaCl（300mM），得到最终浓度，室温搅拌30分钟，以允许激动剂结合。
3. 将膜悬浮液在冰浴中冷却至4℃。使用磁力搅拌棒快速搅拌，通过加入DM来提供最终浓度为2％（w/v）的膜，使其在4℃下缓慢搅拌30分钟。
4. 将溶液转移到8个Ti70管中，并在4℃下在Ti70转子中以265,000 x g（60,000 rpm）离心2小时。
5. 取出上清液并通过0.2μmSteritop过滤器过滤。（见注4）
6. 在4℃下以2ml/min的流速将滤液（〜150ml）装入5ml Ni 2 O 3 -NTA Superflow柱（用缓冲液B预平衡）中，使用蠕动泵。滤液在装载时应保持在冰上。
7. 用100ml缓冲液C以4ml流速5ml/min洗涤柱子。
8. 在4℃以2ml/min的流速用20ml缓冲液D洗脱柱，收集单一的20ml级分。
9. 在4℃的冷藏台式离心机中，使用Amicon Ultra-15浓缩器（50kDa分子量截留）将洗脱液浓缩至5ml。（见注5）
10. 使用两个PD-10脱盐柱（每个柱上加入2.5ml）将浓缩的蛋白质交换到缓冲液E中。（见注6）
11. 加入TEV蛋白酶，得到约1:3（w/w）的TEV：A 2AR比，在冰上孵育过夜。
12. 加入2ml Ni-sup + -NTA琼脂糖树脂（用缓冲液E预平衡），在辊式混合器中在4℃下混合30分钟。
13. 将悬浮液倒入1ml装在一次性塑料柱中的Ni 2+/NTA琼脂糖树脂（用缓冲液E预平衡），使其通过重力流过。
14. 收集流过并用2×3ml缓冲液E洗涤柱。
15. 在4℃的冷藏台式离心机中使用Amicon Ultra-15浓缩器（50kDa截留）浓缩至0.2ml浓缩至0.2ml。
16. 在TLA55转子中使用台式超速离心机在4℃下离心135,000 x g（55,000 rpm）的浓缩蛋白质10分钟以去除聚集体。
17. 将上清液加载到Superdex 200 GL 10/300凝胶过滤柱（用缓冲液E预平衡）中，在4℃以0.4ml/min的流速，收集0.5ml级分。
18. 基于凝胶过滤色谱的池峰分数（通常为3-4ml）。（见注7）
19. 使用Amicon Ultra-4浓缩器（50 kDa截止值）在4°C的冷藏台式离心机中将合并的馏分浓缩至0.2 ml。
20. 使用酰胺黑测定法确定蛋白质浓度（Schaffner和Weissmann，1973）。（见注8）
21. 如果需要，纯化的A 2A R可以等分，在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。（见注9）
A 2A< R-mini-G>>复合物的结晶
首先在DM中制备A 2A'R-mini-G'复合物，一旦形成复合物，其稳定足够被交换成用于蒸气扩散的辛基硫代葡萄糖苷（OTG）结晶试验。在同伴手稿（Carpenter and Tate，2017）中提供了用于表达和纯化mini-G 的详细方案。
1. 将2mg A 2AA R等分到微量离心管中并加入1.2倍摩尔过量的mini-G ++构建体414（1.8mg）。用缓冲液E将体积调节至0.2ml，加入MgCl 2，终浓度为1mM，加入0.1单位的apyrase。在冰上孵育3-16小时。（见注10）
2. 通过稀释缓冲液F中的复合物1:10开始洗涤剂交换（从DM到OTG），并使用Amicon Ultra-4浓缩器（50kDa截止值）在4°冷藏台式离心机中再浓缩至0.2ml C.
3. 使用台式超速离心机在4°C下离心TLA55转子55,000 rpm（135,000 x g）的浓缩蛋白，以清除聚集体。
4. 通过将上清液加载到Superdex 200 GL 10/300凝胶过滤柱（用缓冲液F预平衡）中，在4℃以0.5ml/min的流速加载洗涤剂交换，收集0.5ml级分。
5. 基于凝胶过滤色谱图的池峰分数（通常为2-3ml）（图3）
  
  图3.A.2A R R纯化的SDS-PAGE和凝胶过滤分析.A和B。代表性A 2A的纯化的SDS-PAGE分析 R构造。尽管分子量分别为35和27kDa，A 2 R R和mini-G 4 414在SDS-PAGE凝胶上以相同的速率迁移，使得可视化复杂难因此，为了说明的目的，我们显示了包含N-末端硫氧还蛋白融合物（TrxA-A 2AiR）的A 2AA构建体的SDS-PAGE凝胶，其增加其分子量至46kDa。使用与对A 2A R所述相同的方案，在DM中纯化TrxA-A 2AA，然而TrxA-A 2A-R-被交换成OTG的mini-G 复合物没有产生衍射到高于分辨率的晶体。 A.TrxA-A 2A纯化的SDS-PAGE分析：（M）分子量标记; （1）Ni ^{2 +} -NTA柱装载材料（1:10稀释）; （2）Ni ^{2 +} -NTA柱流过（1:10稀释）; （3）Ni ^{2 + -NTA柱洗; （4）Ni ^{2 + -NTA柱洗脱液; （5）浓缩和缓冲液交换后的样品; （6）TEV消化后样品; （7）Ni ^{2 +} -NTA负净化流过; （8）Ni ^{2 + -NTA阴性纯化洗脱液; （9）凝胶过滤池。 TEV蛋白酶由星号表示。在加入凝胶之前，不应将样品煮沸（见附注11）。 B.洗涤剂交换成OTG：（M）分子量标记物后，TrxA-A 2A R-mini-G 404复合物的SDS-PAGE分析; （1）凝胶过滤池。 C.在OTG中的A2A-R-mini-G 404复合物的合成凝胶过滤色谱图，合并的级分（通常为2-3ml）由虚线表示。请注意，紫外检测器达到饱和，这导致截断的吸光度分布。 D.在欧洲同步加速器辐射设备（尺度标尺为...）处安装在束线ID23-2上的环路中的A 2A'R-mini-G 404复合物的晶体50 x 100μm）}}}
6. 使用Amicon Ultra-4浓缩器（50kDa截留）将浓缩的馏分浓缩至≥20mg/ml，在4℃的冷冻台式离心机中。
7. 在TLA55转子中使用台式超速离心机在4℃下离心135,000 x g（55,000 rpm）的浓缩蛋白质10分钟以去除聚集体。
8. 将上清液转移到新管中，弃去沉淀。
9. 使用酰胺黑测定准确测定复合物的浓度（Schaffner和Weissmann，1973）
10. 将复合物稀释至20 mg/ml，并立即在96孔坐落液滴板中设置结晶试验，使用位于4°C的冷室中的蚊子结晶机器人，分配120 n1蛋白质和120 nl沉淀剂溶液。（见注12）
11. A 2A> R-mini-G 404复合体的初始命中来自MemGold< sup>< sup>筛选（0.1M醋酸钠pH5.5， 8.8％[w/v] PEG 2000 MME）。用于结构测定的两种晶体生长在：0.1M乙酸钠pH 5.5,10％（w/v）PEG 2000中;或0.1M乙酸钠pH 5.7,9.5％（w/v）PEG 2000 MME。
12. 在4°C的寒冷室中收获晶体。在液氮中快速冷冻之前，将补充有浓度增加浓度（10％，20％，30％）冷冻保护剂PEG 400（每种溶液1分钟）的母液滴转移到晶体上。（见附注13）

数据分析

使用UNICORN软件可视化色谱图，并使用GraphPad Prism 7绘制图形。本工作不需要统计学分析。

笔记

这里描述的A 2A R构型包含去除柔性C-末端的缺失，该缺失的长度是用于改善A2AR-mini-Gs晶体的衍射的一个优化领域。使用由残基1-308,1组成的A 2A Sub构建体进行A 2AA-R-mini-G n复合物的结晶试验-311或1-317。使用由A 2A R的残基1-308组成的构建体观察到最佳的衍射。 A< 2A> R-mini-G>结构（Carpenter等人，2016）揭示了A _2A R涉及晶体接触，这就解释了为什么不同长度的A 2A R构型影响复合物的结晶。
使用C末端10x组氨酸标签和TEV蛋白酶切割位点，因为我们的实验室先前已经使用该策略来纯化和结晶热稳定的A 2A/R构建体（Lebon等人，，2011a和2011b; Lebon和Tate，2015）。 10x组氨酸标签优于6x组氨酸标签，因为它以更高的亲和力结合Ni 2+/NTA树脂，因此允许在洗涤步骤期间使用较高的咪唑浓度（高达80mM）这显着提高了受体的纯度
重要的是要正确填充Ti45超速离心管（颈部）。部分填充的管可能在离心过程中塌陷，从而损坏盖组件和转子
由于其高粘度和颗粒物质的存在，上清液的过滤通常需要六个Steritop过滤器单元。然而，这一步大大延长了Ni ^{2 +} -NTA色谱柱的使用寿命，可以再生10次。
当浓缩A 2A R以使温度保持在4℃时，重要的是使用冷藏式离心机。位于寒冷室内的非冷冻离心机将在运行过程中迅速升温，这将导致温度敏感受体的变性。
缓冲液交换后，在与TEV蛋白酶过夜温育期间，可观察到白色沉淀。该沉淀物的组成是未知的，但它不含有显着量的A2AR，并且可以在4℃下以5,000×g离心5分钟除去Ni 2+ -NTA负净化步骤。
A 2A R通常从制备型凝胶过滤柱洗脱，为体积为3-4ml的宽不对称峰。其原因尚不清楚，但可能是由于增溶和净化所带来的过量洗涤剂，会影响Aβ2A R通过凝胶过滤基质的迁移。在制备凝胶过滤运行中汇集并浓缩峰分数后，可以在同一柱上重新运行A 2A R（〜100μg）的小分析样品。该样品应该作为尖峰解析，并且比制备型凝胶过滤曲线更好地指示纯化受体的质量。
酰胺黑测定（Schaffner和Weissmann，1973）是在洗涤剂和配体存在下准确测定膜蛋白浓度的最可靠方法之一。
已经冷冻和解冻的2A 2A保留其形成具有小-Gas的复合物的能力，并且该复合物可以结晶，与使用新鲜时观察到的结果相似。制备受体。缓冲液E含有10％甘油，因此不需要额外的冷冻保护剂。
测试的最短孵育时间为3小时，之后完全形成A 2A'R-mini-G'复合物。然而，过夜孵化不会对复合物的稳定性产生负面影响，而且通常更为方便
膜蛋白样品在加载SDS-PAGE之前不应该煮沸，因为这会使蛋白质聚集
结晶板必须设置并在4℃下孵育，即使短期暴露于高温也会导致复合物变性。
使用30％PEG 400的低温保护导致晶体的可见收缩。这种脱水的程度在晶体之间变化，意味着从不同晶体收集的数据集难以合并。逐步增加冷冻保护剂的浓度导致晶体更均匀的脱水，并允许收集可靠可靠的衍射数据。
PMSF溶液必须在无水溶剂（如无水乙醇）中制备，因为即使少量的水分会导致PMSF的快速水解，使其无活性。以无水乙醇制备的PMSF储备溶液是稳定的，可以方便地在4℃下储存几个月。注意，PMSF溶液在打开前应加热至室温，以防止冷凝物进入溶剂。

食谱

缓冲区A
20 mM HEPES，pH 7.5
1 mM EDTA
1毫升PMSF（立即使用前添加）
PMSF库存解决方案
无水乙醇200mM，储存于4℃（见附注14）
NECA库存解决方案
在DMSO中10 mM，储存于-20°C
DM股票解决方案
在Milli-Q水中20％w/v，储存于-20°C
缓冲区B
20 mM HEPES，pH 7.5
300 mM NaCl
10 mM咪唑
100μMNECA（使用前立即添加）
0.15％（w/v）DM（立即使用前添加）
使用0.22微米的Steritop或注射器过滤器过滤
缓冲区C
20 mM HEPES，pH 7.5
500 mM NaCl
80 mM咪唑
10％（v/v）甘油 100μMNECA（使用前立即添加）
0.15％（w/v）DM（立即使用前添加）
使用0.22微米的Steritop或注射器过滤器过滤
缓冲区D
20 mM HEPES，pH 7.5
100 mM NaCl
300毫克咪唑
10％（v/v）甘油 100μMNECA（使用前立即添加）
0.15％（w/v）DM（立即使用前添加）
使用0.22微米的Steritop或注射器过滤器过滤
缓冲区E
10mM HEPES，pH7.5
100 mM NaCl
10％（v/v）甘油 100μMNECA（使用前立即添加）
0.15％（w/v）DM（立即使用前添加）
使用0.22微米的Steritop或注射器过滤器过滤
OTG库存解决方案
在Milli-Q水中为15％w/v，储存于-20°C
Apyrase储备溶液
在Milli-Q水中1单位/μl，储存于-20°C
缓冲区F
10mM HEPES，pH7.5
100 mM NaCl
1mM MgCl 2
100μMNECA（使用前立即添加）
0.35％（w/v）OTG（立即使用前添加）
使用0.22微米的Steritop或注射器过滤器过滤

致谢

这项工作由Heptares Therapeutics有限公司的资助和医学研究委员会的核心资金[MRC U105197215]资助。该协议的一部分是从先前描述的方法（Lebon等人，2011a和2011b; Tate和Lebon，2015; Carpenter等人，2016）改编的。我们感谢RonyNehmé对手稿的意见。

参考文献

Carpenter，B.，Nehmé，R.，Warne，T.，Leslie，AG和Tate，CG（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="https：//www.ncbi.nlm。 nih.gov/pubmed/27462812"target ="_ blank">与工程化G蛋白结合的腺苷A 2A亚型的结构自然 536（7614 ）：104-7。
Carpenter，B.和Tate，CG（2016）。工程化最小的G蛋白质以促进G蛋白偶联受体在其活性构象中的结晶。蛋白质工程技术29（12）：583-594。
Carpenter，B. and Tate，CG（2017）。表达和纯化大肠杆菌中的迷你G蛋白质。生物方案7（8）：e2235。
Lebon，G.，Bennett，K.，Jazayeri，A.和Tate，CG（2011a）。人腺苷A 2A受体的激动剂结合构象的热稳定化.Mol Biol 409（3）：298-310。
Lebon，G.，Warne，T.，Edwards，PC，Bennett，K.，Langmead，CJ，Leslie，AG and Tate，CG（2011b）。< a class ="ke-insertfile"href ="https： //www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21593763"target ="_ blank">激动剂结合的腺苷A 2A亚型受体结构揭示了GPCR激活的常见特征。 >自然 474：521-5。
Schaffner，W.和Weissmann，C.（1973）。用于测定稀释溶液中蛋白质的快速，灵敏和具体的方法。 Anal Biochem 56（2）：502-514。
Tate，CG和Lebon，G.（2015）。人腺苷A 2A受体的热稳定激动剂结合构象的纯化和结晶。方法Mol Biol 1335：17-27。