材料和试剂

注意：以下列出的大多数试剂都提供了目录号。来自替代供应商的等效质量试剂通常可以用可比较的结果代替。由于污染RNase引入的人工制品的潜力，应注意遵循最佳实践，例如使用无RNA酶的溶液和试剂和/或酌情使用DEPC处理（Farrell，2010）。需要尿素 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳的标准材料和试剂;我们使用国家诊断系统，但是可以使用标准方法制备这种凝胶（Sambrook和Russell，2006）。

移液器提示
1.5ml微量离心管（例如，Eppendorf，目录号：022363204）
10-Gel Gel Combs 1.5mm（Thermo Fisher Scientific，Novex ^{TM，目录号：NC3510）}
空的凝胶盒，迷你，1.5毫米（Thermo Fisher Scientific，Novex ^{TM，目录号：NC2015）}
注射器用弯针（在样品加载前将残留的尿素从凝胶孔中清洗）
HEK-293 Flp-In T-REx EXOSC10-3xFLAG细胞（[Domanski等人，2016];可应要求提供）亲代HEK-293 Flp-In T-REx细胞系（Thermo Fisher Scientific ，Invitrogen ^{TM，目录号：R78007）}
无核酸酶的水（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM9932）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
2- [4-（2-羟乙基）哌嗪-1-基]乙磺酸（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：54457）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
抗-FLAG M2（Sigma-Aldrich，目录号：F3165）抗体缀合的Dynabeads M-270环氧树脂（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：14302D）（Domanski和LaCava，2017） />
二硫苏糖醇（DTT）（Sigma-Aldrich，目录号：43815）
氯化镁（MgCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：M8266）
在5'端具有6-羧基荧光素（6-FAM）的RNA底物（在10mM HEPES〜pH7-7.5中重构，0.5nmol /μl，储存等分试样于-80℃）
1. 通用底物：5' - （6-FAM）-CCUAU UCUAU AGUGU CACCU AAAUG CUAGA GCU modC（2'-O-Me）-3'
2. 封闭的底物：5' - （6-FAM）-CCUAU UCUAU AGUGU CACCU AAAUG CUAGA GCU modC（2'-O-Me，3'-PO 4）-3'
注意：两种底物均按照100nmole级别从Integrated DNA Technologies订购，通过无RNA酶的HPLC纯化。
RNasin ^{核糖核酸酶抑制剂（Promega，目录号：N2515）}
甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：47671）
DNA加载染料（Thermo Fisher Scientific，目录号：R0611）
注意：由10mM Tris-HCl（pH 7.6），0.03％溴酚蓝，0.03％二甲苯氰醇FF，60％甘油，60mM EDTA组成，因此可以制备而不是购买。 >
乙二胺四乙酸（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E6758）
Tris碱（Sigma-Aldrich，目录号：93362）
硼酸（H 3 O 3 BO 3）（Sigma-Aldrich，目录号：B7901）
四甲基乙二胺（TEMED）（Sigma-Aldrich，目录号：N，/， T7024）
过硫酸铵（APS）（Sigma-Aldrich，目录号：A3678）
注意：在H ₂ O中准备10％的解决方案，并在4°C下保存数周。
UreaGel 29：1变性凝胶系统（国家诊断，目录号：EC-829）
回收溶液（参见食谱）
清洗液（参见食谱）
2x反应溶液（参见食谱）
2x RNA加载溶液（参见食谱）
1x TBE（5x或10x库存可以准备）（见配方）

设备

注意：需要用于尿素 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳的标准设备，以及能够进行荧光素检测的成像仪（吸收λmax = 494nm，发射λmax max/= 518nm）

移液器
Vortexer
台式微型离心机
钕磁铁微型管架（Thermo Fisher Scientific，目录号：12321D）
Thermomixer（例如，Eppendorf，型号：ThermoMixer F，目录号：5355000.011;或等效物）
XCell SureLock Mini（Thermo Fisher Scientific，型号：SureLock ^® Mini-Cell，目录号：EI0001）
电泳电源
具有蓝光（460nm）外照相和Y515-Di（长通）滤光片的成像器，即，SYBR绿色设置。富士胶片LAS-3000系列或更高版本（Fujifilm，型号：LAS-3000系列;或同等品牌）

程序

注意：如补充方案所述纯化含有EXOSC10的RNA外来体，如HEK-293细胞（Domanski和LaCava，2017）的RNA外来体亲和纯化或其他方式。如先前所述（Domanski等，2016），该测定也可以有效地应用于亲和纯化的DIS3-3xFLAG。可以在我们的在线视频协议（LaCava et al。，2016）中查看与以下协议的亲和力捕获方面相关的操作示例。

从甘油梯度重新捕获RNA外来体
1. 从梯度中回收级分后，最多聚集到构成完整的含EXOSC10的外来体的峰的两个级分（总共达到〜450μl）。
  注意：如果需要，请保存最多50μl（输入）的等份用于其他分析。
2. 添加等体积的重新捕获解决方案（参见配方1）。
3. 用1 ml的再吸收溶液预洗10μl抗FLAG磁性介质（浆液）两次注意：将1ml的再吸收溶液与珠浆料混合并短暂涡旋。在小型离心机中旋转管子以收集底部的所有溶液，然后将管放置在磁性管架上。等待珠子收集在管的一侧并除去上清液（使用移液管或吸气器）。向管中的珠添加另外的再捕获溶液，并重复第二次洗涤的过程;除去上清液后，珠可以保持在冰上并准备使用。两种洗涤步骤都可以在室温下进行。
4. 将来自步骤A2的稀释级分转移到具有预洗珠的1.5ml管中
5. 孵育30分钟，旋转4°C（冷室）。
6. 放在磁铁上，等到珠子收集在管子的侧面，然后取出上清液。
  注意：上清可以通过蛋白质染色或蛋白质印迹与输入进行比较，以监测外来体消耗的程度。
7. 用1ml洗涤溶液洗涤一次（参见方法2）。
8. 将亲和介质重悬于25μl洗液中
9. 加入25μl2x反应溶液（参见配方3）。
10. 在37℃下以1,000rpm混合培育
11. 通过在不同时间点（例如，0,2.5,5,15和30分钟）取10μl等分试样来产生反应的时间过程。通过加入10μl2x RNA加载缓冲液停止反应（参见配方4）。
  注意：该测定应理想地包括设置为独立反应的两个对照：a）如上所述，但使用封闭的底物，和b）与亲和介质和含有通用底物的反应溶液的模拟反应，但不含RNA外来体。两个对照应该在整个时间过程中显示完整底物的存在，表明制剂和溶液没有干扰RNase污染。 DIS3能够降解3'-PO 4阻断的底物。
12. 放在磁铁上，并将上清液转移到新鲜管中。保持冰上。
RNA PAGE和凝胶成像
1. 根据制造商的说明，投入20％的尿素 - 聚丙烯酰胺10孔凝胶。
2. 将凝胶在1x TBE（参见配方5）中以15 W预处理15-20分钟。
  注意：预运行步骤清除了凝胶中过量的自由离子，影响电流和发热。在预运行和运行期间，磁带将温暖;典型工作温度在45-60°C之间。所产生的热可能有助于将RNA样品维持在变性的单链形式;对于缺乏强大的二级结构的小型寡核苷酸底物，这并不是预期的主要变量。
3. 将样品在80℃下加热30秒，然后放在冰上。装载之前，请稍后旋转。
  注意：加热样品使RNA变性并解离RNA蛋白组装。
4. 使用带有弯针的注射器从孔中清洗尿素。
5. 在凝胶上加载每个样品的每个样品的体积（20μl）。
6. 以15 W运行，直到溴酚蓝跟踪染料从塑料胶盒底部到达第一行。
7. 打开盒式磁带并使用适当配置的成像器（富士LAS系列上的SYBR绿色）直接成像。
  注意：凝胶在成像之前不需要固定，洗涤或干燥。根据检测到的活动水平，在数据收集之后，软件中的图像亮度/对比度的一些调整可以改善可视化。

数据分析

EXOSC10的分布式3'-5'exoribonucleolytic活性可以看作是底物降解中间体的"梯度"，随着时间的推移越来越多地转向较低的分子量物种;并因此越来越多地朝向凝胶的底部。这种模式如图1所示。梯子的最后一步（ ie ，最新时间点）可能会相对于较早的时间点出现压缩，因为酶可能不会在末端显示明显的活动缩短的底物池和池的其余部分收敛于这个大小。 3'-PO 4封闭的底物将阻止EXOSC10衍生的3'-5'活性;在这种情况下，应在所有时间点观察全长底物和不存在分解产物。但是，请注意，这个期望假定不存在DIS3，或者纯化的外来体中存在的任何DIS3已被灭活（Domanski等人，2016; Zinder等人）。，2016）

图1.代表性的结果：使用亲和纯化的人类RNA外源体复合物的RNA降解测定。如本方案所述，外源核糖核酸酶测定的反应产物的尿素 - 聚丙烯酰胺凝胶分离示意图，一致具有分布式活动模式和原始数据。 B.从（Domanski等人，2016）转载的原始凝胶：将ExoI制剂与普通或封闭的底物一起温育，并收集指定的时间点。

食谱

回收方案
100 mM NaCl
20 mM HEPES，pH 7.4
1％Triton X-100
清洗液
100 mM NaCl
20mM Tris-HCl，pH8.0
0.01％Triton X-100
2x反应液
2x反应液
20mM Tris-HCl，pH8.0
20 mM DTT
0.5mM MgCl 2
5％（v/v）RNasin 核糖核酸酶抑制剂
0.4pmol/μlRNA底物
2x RNA加载溶液
95％甲酰胺
1％DNA负载染料
20 mM EDTA
1×TBE（5x或10x股票可以准备）
89 mM Tris碱基
89 mM硼酸
2 mM EDTA

致谢

感谢Michael P. Rout教授和Torben Heick Jensen教授对我们研究的宝贵支持。我们还感谢Artem Serganov先生和Zhanna Hakhverdyan博士作证。这项工作得到了美国国家卫生研究院授予的P41GM109824和P50GM107632，Lundbeck基金会和丹麦国家研究基金会的支持。

参考文献

Domanski，M.和LaCava，J.（2017）。亲和纯化来自HEK-293细胞的RNA外来体。 7（08）：e2238。
Domanski，M.，Molloy，K.，Jiang，H.，Chait，BT，Rout，MP，Jensen，TH and LaCava，J.（2012）。改进在近内源水平表达的人类蛋白质复合物的亲和力分离的方法。生物技术 0（0）：1-6。
Domanski，M.，Upla，P.，Rice，WJ，Molloy，KR，Ketaren，NE，Stokes，DL，Jensen，TH，Rout，MP and LaCava，J.（2016）。< a class = -insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27402899"target ="_ blank">内源性人RNA外显子复合物的纯化和分析。 em> 22（9）：1467-1475。
Farrell，R.E。（2010）。 RNA Methodologies。第4版
Kilchert，C.，Wittmann，S。和Vasiljeva，L。（2016）。核RNA外显子复合物的调节和功能。 Nat Rev Mol Cell Biol 17（4）：227-239。
LaCava，J.，Jiang，H.and Rout，MP（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5226390 /"target ="_ blank">来自低温哺乳动物细胞的蛋白质复合物亲和力捕获。 J Vis Exp e54518。
Sambrook，J。和Russell，DW（2006）。< a class ="ke-insertfile"href ="https://www.amazon.com/Condensed-Protocols-Molecular-Cloning-Laboratory/dp/0879697717 "target ="_ blank">缩写协议。第一版冷泉港实验室出版社。
Wasmuth，EV和Lima，CD（2012）。结构和真核RNA外来体的活性。酶：31：53-75。
Zinder，JC，Wasmuth，EV和Lima，CD（2016）。