材料和试剂

1.5 ml微量离心管
无菌Sterilin ^{TM 10cm平方厘米用于植物生长培养基的培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：109）}}
22×22毫米1号玻璃盖玻片（VWR，目录号：631-0124）
聚-L-赖氨酸载玻片（Sigma-Aldrich，目录号：P0425）
剃刀刀片（Agar Scientific，目录号：AGT586）
密封胶膜（Bemis，目录号：PM992）
杂交室
注意：虽然这些产品可以在市场上销售（Corning，目录号：2551），我们使用了10厘米平方英尺的培养皿，外面涂上一层黑色绝缘胶带（RS Components，目录号：494-405）。然后将双层组织（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：7557）置于碱中并用无菌水饱和，然后将载玻片置于单层Parafilm顶部（参见图1）。

图1.用于smFISH实验的杂交室的图示
低成型制备盘（VWR，目录号：470144-866;或类似的边缘玻璃皿）
拟南芥根
次氯酸钠（NaClO）（VWR，BDH ，目录号：CABDH7038-4L）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378-1KG）
Phytagel（Sigma-Aldrich，目录号：P8169）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
不含核酸酶的磷酸盐缓冲盐水溶液（PBS，10x）pH 7.4（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^{TM，目录号：AM9624）}
液氮
适用于分子生物学的乙醇
无核酸酶20倍生理盐水 - 柠檬酸钠（20×SSC）（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^{TM，目录号：AM9763）}
透明指甲油（电子显微镜科学，目录号：72180;或类似）
硫酸葡聚糖（Sigma-Aldrich，目录号：RES2029D）
定制RNA FISH Stellaris 探针套件
我们使用在线Stellaris Probe Designer来设计我们的smFISH探针集： https://www.biosearchtech.com/support/education/stellaris-rna-fish 。我们使用默认屏蔽级别2来避免一般有问题的RNA序列，并选择最多48个探针，寡核苷酸长度为20 nt，探针之间的最小间距为2 nt。
我们还执行了TAIR BLAST搜索（ https://www.arabidopsis.org /Blast/index.jsp ），并综合考虑结果以确保目标特异性。我们发现Quasar 570和Quasar 670染料同样适合在拟南芥根瘤细胞中成像RNA，但是我们无法检测用荧光素修饰的探针标记的RNA。
Murashige&具有维生素的Skoog基础培养基（任何等同的来源都是合适的）（PhytoTechnology Laboratories ^{®，目录号：M519）}
不含核酸酶的Tris-EDTA缓冲溶液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA pH8）（Sigma-Aldrich，目录号：93283）
DAPI（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：D1306）}
葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：158968-500G）
Tris HCl缓冲液1 M pH 8，无核酸酶（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^{TM，目录号：AM9855G）}
葡萄糖氧化酶（Sigma-Aldrich，目录号：G0543）
牛肝过氧化氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：C3155）
去离子甲酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：F9037）
1N HCl（Sigma-Aldrich，目录号：71763）
10％（v/v）漂白剂（Vortex 5-10％次氯酸钠，Procter& Gamble，UK）稀释于dH2 O
TE缓冲液（10nM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0）
无核酸酶水 - 未经DEPC处理（QIAGEN，目录号：129117）
Murashige和Skoog媒体（见食谱）
洗涤缓冲液（见配方）
杂交解决方案（见配方）
DAPI解决方案（见配方）
抗褪色GLOX缓冲液（减去酶）（参见食谱）
抗褪色GLOX缓冲液（含酶）（见配方）

设备

镊子（Fisher Scientific，S Murray ^TM，目录号：E017/01;或类似的）
Coplin罐（Sigma-Aldrich，目录号：S6016;或类似物）
植物生长室（Panasonic Healthcare，Sanyo，目录号：MLR-352H-PE;或类似物）
烟气柜（Labconco，目录号：2247300;或类似）
层流流动柜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Heraguard ^TM ECO Clean Bench Floor Stand，目录号：50109313;或类似的）}
实验室烤箱（Cole-Palmer，目录号：WZ-52412-83;或类似）
轨道摇床（Cole-Palmer，目录号：WZ-51700-13;或类似的）
宽场荧光显微镜
注意：我们使用了Andor iXon EM-CCD摄像头（Andor，型号： iXon EMCCD相机），但是也使用针对低速优化的标准CCD相机获得了类似的图像光级成像。
高数值孔径（> 1.3）和60或100x油浸物镜
强光源，如汞或金属卤化物灯（氙气或LED通常不够亮）
适用于荧光团的滤光片

软件

ImageJ软件： http://rsbweb.nih.gov/ij /index.html （Schindelin等，2015）
FISHcount： https://github.com/JIC-CSB/FISHcount
Graphpad Prism软件或MS Excel

程序

植物生长和显微镜载玻片制备
1. 在1.5 ml微量离心管中倒置5％（v/v）次氯酸钠表面灭菌5 min，然后在无菌蒸馏水中冲洗3次。
2. 将种子放在补充有1％（w/v）蔗糖和0.5％（w/v）植物细胞的Murashige和Skoog培养基（pH 5.8）上。
3. 通过在黑暗中4℃下孵育2天来分层种子。然后，将幼苗在22±1℃，垂直取向的培养皿中生长至少5天（16小时光照和8小时黑暗）。
拟南芥的固定和制备（见图2的概述）

图2.拟南芥根细胞中smFISH的方案步骤。 有关详细信息，请参阅主要文本。
1. 将来自拟南芥幼苗（约1cm）的根尖取出，同时仍然在平板上并放入含有新鲜制备的4％多聚甲醛的小玻璃皿中，并在室温下在通风橱下孵育30分钟。 br />
2. 从固定剂中取出根，用1x PBS洗两次。
3. 将3-4根根部放在幻灯片上，盖上盖玻片。用拇指轻轻地将每根根茎放在载玻片上，小心避免破坏盖玻片。目的是充分发挥根以在单个细胞层中产生多个文件和分离的细胞（参见图3）。
  
  图3.低倍数图像根分生组织南瓜。用DAPI（蓝色）染色的细胞核。该方法产生许多单独的单元格，或单独的文件或文件。比例尺= 200μm
4. 使用镊子将压扁的根部保持在盖玻片下方，并将每个载玻片浸入液氮中约5秒钟。从氮气中取出后，可以使盖玻片和载玻片之间的剃刀刀片松开，然后将盖玻片滑开。
5. 将样品在室温下空气干燥至少30分钟。
  注意：为避免增加自身荧光水平，请勿将其置于干燥时间超过2小时。
6. 通过将载玻片浸入含有70％乙醇的共同浴缸中至室温下至少1小时来使样品透过。固定根可以在杂交前一周内在2-8℃下储存在70％乙醇中。
探针杂交
1. 从乙醇中取出载玻片，使残留的乙醇在室温下蒸发
2. 用洗涤缓冲液在载玻片上洗涤2次5分钟。
3. 通过向100μl杂交溶液（250nM终浓度）中加入1μl所需的探针储备溶液来制备探针溶液。
4. 在每个载玻片上加入100μl探针溶液，用盖玻片盖住，以防止蒸发，并在阴凉处37°C的潮湿室中孵育至少4 h（或过夜）。
样品安装
1. 取出盖子，并将样品在200μl洗涤缓冲液中洗涤2次，载玻片上5分钟
2. 将载玻片浸入含有约30ml洗涤缓冲液的同种罐中，并在37℃，黑暗中孵育30分钟。
3. 从容器中取出载玻片并加入100μlDAPI溶液，然后在黑暗中37℃孵育30分钟。
4. 用移液器小心吸取DAPI溶液，并用〜100μl2x SSC冲洗。
5. 取出2x SSC，加入100μl抗褪色GLOX缓冲液（减去酶）。让它平衡1-2分钟。
6. 去除抗褪色GLOX缓冲液（减去酶），并在每个载玻片上加入100μl抗褪色GLOX缓冲液（含酶）。
7. 用盖玻片覆盖样品，除去多余的抗褪色GLOX缓冲液（加酶）并用指甲油密封。
8. 在同一天拍摄幻灯片，以避免样品干燥和荧光团褪色。
成像
1. 图像采集在宽视场荧光显微镜上，每个z平面的光学切片尺寸为0.2μm，横跨细胞的整个体积（约5μm，取决于细胞大小）。曝光时间取决于显微镜设置（光源，目标，等）。我们使用蔡司Elyra PS采用100x油浸物镜（1.46 NA）和冷却电子倍增CCD（电荷耦合器件）Andor iXon 897相机（512 x 512，QE> 90％）拍摄了我们的图像。对于用Quasar 570标记的探针，使用561nm的激发线，并在570-640nm检测到信号;对于用Quasar 670标记的探针，642nm的激发线和在655-710nm处检测到信号;对于DAPI，405nm的激发线和在420-480nm的波长处检测到信号。通常，我们对DAPI使用30毫秒的曝光时间，对于Quasar染料使用200-300毫秒。
2. 在图像采集后，可以使用ImageJ（Image/Stack/Z Project）中的最大投影命令将Z-stacks缩小为2D数据集。有关此步骤的详细说明，请参阅ImageJ用户指南： https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide.pdf 。最大投影命令将导致具有与单个RNA相对应的衍射受限点的图像。当外源探针与同一基因的内含子探针结合使用时，一些斑点将在核内共定位，对应于在固定时转录的新生RNA分子（图4）。
  
  图4.单细胞中FLC转录物的检测。 A.用于检测FLC转录物的探针的示意图：内含子（红色）和外来（绿色）。 FLC 外显子以粗线表示，内含子显示为细线。 B.在拟南芥根瘤细胞中显示出新生RNA（红色）表达的mRNA（绿色）和 FLC 的代表性图像。细胞质中的衍射受限斑点对应于单个FLC mRNA分子（绿色），并且与内含子信号（红色）共定位的强点对应于转录位点。根据细胞周期阶段，内含子信号可以检测多达2个点（G1期）或4个点（G2期）。细胞核用DAPI染色，显示为蓝色。刻度棒=5μm。

数据分析

对于我们的图像分析，我们使用了公认的mRNA计数程序，该程序已被优化用于我们的实验设置。有关如何在Mac计算机上安装此程序的详细信息，请参见 https：//github.com/JIC-CSB/FISHcount 。
注意：对于希望在Windows机器上量化FISH数据的研究人员，我们建议使用FISH-quant（Mueller等，2013）。
图6显示了FISHcount产生的"RNA识别"，"细胞分割"和"每个细胞的mRNA"输出图像的例子。在对整个数据集执行分析之后，我们建议您手动检查每个"每个细胞的mRNA"输出图像（图6D），以确保图像分析工作流程通过不正确的分割未产生不准确的结果。图像分析工作流程的详细说明也可以在Duncan等人的"2016"（图5）中找到。
然后可以使用GraphPad Prism或MS Excel记录和绘制数据，如图7所示。

图5.图像分析工作流程（改编自Duncan等，2016）

图6.FLC mRNA的自动图像分析。 A.用FLC mRNA探针标记的细胞的代表性最大投影图像（绿色）。用DAPI标记的DNA（蓝色）。 B-D。显示用于确定阳性mRNA信号的顺序检测步骤的屏幕截图。 mRNA位点;细胞分裂; D.每个细胞的mRNA数量的输出图像。比例尺= 5微米。

图7.每个细胞的FLC mRNA分子的频率分布从三个实验分析总共520个细胞。误差棒为±SEM。

食谱

Murashige和Skoog媒体
0.025mg/L CoCl 2·6H 2 O
0.025mg/L CuSO 4·5H 2 O
36.7 mg/L Na·Fe-EDTA
6.2mg/L H 3 BO 3 3/
0.83 mg/L KI
16.9mg/L MnSO 4·2H 2 O ○
0.25mg/L Na 2 MoO 4·2H 2 O
8.6mg/L ZnSO 4·7H 2 O
332.02mg/L CaCl 2·2H 2 O ○
170mg/L KH PO 4
1,900 mg/L KNO 3
180.5mg/L MgSO 4·7H 2 O
1,650mg/L NH 4 NO 3（pH 5.8）
1％蔗糖
0.5％phytagel
洗涤缓冲液
10％甲酰胺
2x SSC
杂交解决方案
100毫克/毫升葡聚糖硫酸盐
10％甲酰胺
2x SSC
smFISH探针库（25μM）
Stellaris 5 nmol寡聚探针组
200μlTris-EDTA缓冲溶液
DAPI解决方案
100 ng /μlDAPI
10％甲酰胺
2x SSC
抗褪色GLOX缓冲液（减酶）
0.4％葡萄糖
10nM Tris-HCl
2x SSC
抗褪色GLOX缓冲液（含酶）
最终体积为102μl，混合：
100μl抗褪色GLOX减去酶溶液
1μl葡萄糖氧化酶
1μl牛肝过氧化氢酶悬浮液（温和涡旋）

致谢

这项工作得到英国生物科技和生物科学研究理事会（BBSRC）授予BB/K00008X/1和地球与生命系统联盟（John Innes Center与东英吉利大学合作）的支持。 S.R.承认来自洪堡基金会（德国）的3.3-GRO/1162118STP的支持。 S.D.承认OpenPlant Grant BB/L014130/1的支持。光盘。承认欧洲研究理事会高级授权MEXTIM和BBSRC研究所战略计划授权BB/J004588/1的支持。原始作品发表于Duncan等人。（2016）和Rosa等人。（2016）。

参考文献

Duncan，S.，Olsson，TSG，Hartley，M.，Dean，C.andRosa，S。（2016）。检测拟南芥中单RNA分子的方法 em> Plant Methods 12（1）：1-10
Mueller，F.，Senecal，A.，Tantale，K.，Marie-Nelly，H.，Ly，N.，Collin，O.，Basyuk，E.，Bertrand，E.，Darzacq，X和Zimmer，C 。（2013）。 FISH-quant：自动计数3D FISH图像中的成绩单。 10（4）：277-278。
Raj，A.，van den Bogaard，P.，Rifkin，SA，van Oudenaarden，A.和Tyagi，S。（2008）。使用多个单独标记的探针成像个体mRNA分子。 Nat方法5（10）：877-879。
Rosa，S.，Duncan，S.and Dean，C.（2016）。 FLC 中的互斥义 - 反义转录促进环境诱导的基因抑制。 Nat Commun 7：13031.
Schindelin，J.，Rueden，CT，Hiner，MC和Eliceiri，KW（2015）。 ImageJ生态系统：生物医学图像分析的开放平台。 Mol Reprod Dev 82（7-8）：518-29。