材料和试剂

15ml离心管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352096）}
培养皿培养（Nest Biotechnology，目录号：704001）
10号手刀刀片外科手术刀（BD，目录号：371610）
细胞过滤筛（Corning，Falcon ^{®，目录号：352340）}
50ml离心管（Corning，Falcon ^{®，目录号：352070）}
T25烧瓶培养（Nest Biotechnology，目录号：707003）
1 ml微管（Nest Biotechnology，目录号：613111）
具有高透明度的聚苯乙烯的24孔板（Nest Biotechnology，目录号：702001）
5ml移液管（Nest Biotechnology，目录号：326001）
成胶质细胞瘤多形性样品（人）
Hanks的平衡盐溶液（HBSS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：24020117）}
抗生素 - 抗真菌药（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15240062）}
0.25％胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25200056）}
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10270106）}
台盼蓝溶液0.4％（Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
兔抗S100-β的一级抗体（Sigma-Aldrich，目录号：S2644）
兔抗纤连蛋白的抗体（Abcam，目录号：ab23751）
FITC缀合的山羊抗兔（Abcam，目录号：ab6717）
Dulbecco改良的Eagle培养基/F12（DMEM/F12）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：31331028）}
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（片剂）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：18912014）}
多聚甲醛（粉末）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787）
牛血清白蛋白（粉末）（Sigma-Aldrich，目录号：A2058）
培养基（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）
4％多聚甲醛（见食谱）
0.2％Triton X-100（见配方）
10％牛血清白蛋白（见食谱）

设备

通风罩（VISION SCIENTIFIC，型号：VS-7120LV）
37°C水浴（Memmert，型号：WNB14）
离心机（Hettich Lab Technology，型号：Universal 320R）
血细胞计数器（Sigma-Aldrich，目录号：Z359629）
CO 2细胞培养箱（Memmert，型号：INC108 T2T3）
倒置荧光显微镜（Optika，型号：XDS-2FL）
小镊子手术工具（精细科学工具，目录号：11050-10）

程序

原始胶质瘤多形性（GBM）组织的收集
1. 从进行手术治疗的胶质母细胞瘤患者获得多形性成胶质细胞瘤样品。
2. 本研究由德黑兰医科大学伦理委员会批准。手术前，患者签署书面同意书。
3. 与神经外科组协调后，神经外科医生将切除的胶质母细胞瘤样品置于含有10％抗生素（抗生素 - 抗真菌药）的5ml冷HBSS的15ml Falcon管中。
4. 胶质母细胞瘤样品在干冰上输送到实验室。
GBM样品分离成单原发性星形胶质细胞
1. 在生物学的罩下，去除含有胶质母细胞瘤组织的Falcon管中多余的HBSS。用5ml冷PBS洗涤组织3次以除去血液。
2. 将胶质母细胞瘤组织置于装有1ml冷PBS的培养皿中。
3. 用解剖刀刀片切碎并切碎组织5分钟，直到样品转化成乳状悬浮液。粉碎可以通过增加组织解离的功效来帮助加速胰蛋白酶消化过程。
4. 向切碎的组织中加入3ml温（37℃）0.05％胰蛋白酶-EDTA。然后，用胰蛋白酶将悬浮液转移到新的15 ml Falcon管中
5. 在37℃水浴下孵育生产的悬浮液10分钟，以消化切碎的组织。
6. 加入3ml含有10％胎牛血清（FBS）和1％抗生素抗真菌剂的DMEM/F12培养基，以抑制胰蛋白酶的活性。
7. 用5ml移液管吸取悬浮液10次，并在室温下以180 x g离心10分钟。
8. 取出上层液体，并用5ml移液管吸取10次，将得到的颗粒缓慢地悬浮于含有2％FBS和1％抗生素抗真菌剂的5ml DMEM/F12中。
9. 将细胞悬浮液通过40微米的细胞过滤器过滤到50ml管中以除去未解离的碎片和碎屑
10. 将过滤的悬浮液在室温下离心180分钟5分钟
11. 将沉淀的细胞重悬于含有2％FBS和1％抗生素抗真菌剂的1ml DMEM/F12中（图1）。
  
  图1.从人胶质母细胞瘤样品中分离初级星形胶质细胞进行培养的步骤A.手术后人类成胶质细胞瘤样品; B.使用冷PBS洗涤成胶质细胞瘤样品;将胶质母细胞瘤样品转移到培养皿中; D.胶质母细胞瘤样品用手术刀刀片切碎并切碎; E.酶消化后，将细胞悬浮液接种在T25烧瓶中
细胞计数和电镀
1. 每2天更换新鲜培养基的一半细胞培养基。培养基每次变化后，FBS浓度逐渐增加，2周内为2％〜10％（表1）。培养基中的10％FBS量保留在以下初级星形胶质细胞培养物中。
  
  表1.播种后不同天培养基中的FBS浓度
  
  播种后更改媒体天数
  FBS浓度
  
  播种（0）
  2％
  
  4
  3％
  
  6
  4％
  
  8
  5％
  
  10
  6.5％
  
  12
  8％
  
  14
  10％
2. FBS量的逐渐增加可能会避免细胞培养物的成纤维细胞污染（图2）
  
  图2.细胞培养不同日期，多形性成胶质细胞瘤原代星形胶质细胞的相位图。。细胞培养2天后。 B.细胞培养4天后C.细胞培养9天; D.细胞培养14天。比例尺=100μm
GBM原发性星形胶质细胞的亚文化
1. 使用倒置显微镜检查细胞融合水平。在播种后3周达到融合的80％时对细胞进行细菌培养。
2. 使用5ml无菌移液管在生物罩下从每个T25烧瓶中取出培养基
3. 用3ml温热（37℃）PBS洗涤细胞，然后除去PBS。
4. 在孵育器中用1ml温（37℃）0.05％胰蛋白酶-EDA分离细胞1分钟。
5. 通过向每个T25烧瓶中加入含有10％FBS和1％抗生素抗真菌剂的4ml DMEM/F12，然后将细胞悬浮液从每个烧瓶转移到15ml Falcon管中，从而抑制胰蛋白酶-EDTA的反应。
6. 将细胞悬浮液在室温下以250×g离心5分钟
7. 用5ml无菌移液管从每个管中取出培养基。
8. 在每个管中用1ml含有DMEM/F12,10％FBS和1％抗生素 - 抗霉菌剂的新鲜培养基重悬。
9. 重新悬浮和计数后，将细胞在24孔培养皿（每孔5×10 3个细胞密度）中平板化，进行免疫细胞化学分析，并用T25烧瓶进行亚培养。 >
S100-β染色
1. 将种子5×10 3个细胞注入24孔培养皿的每个孔中
2. 在室温下24小时后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）将每孔洗涤三次
3. 用PBS中的4％多聚甲醛固定细胞20分钟
4. 在PBS中，室温洗涤细胞三次，每次5分钟
5. 用0.2％Triton X-100渗透细胞膜15分钟
6. 在PBS中，室温洗涤细胞三次，每次5分钟
7. 用10％牛血清白蛋白封闭细胞1 h
8. 用含有1％BSA的PBS稀释兔抗S100-β1：100的一抗
9. 在4℃下将细胞与兔抗S100-β的一级抗体或兔抗纤维连接蛋白的一级抗体孵育过夜。
10. 在PBS中，室温洗涤细胞三次，每次5分钟
11. 用含有1％BSA的PBS稀释FITC-缀合的山羊抗兔1：500的二抗。
12. 在室温下在黑暗中孵育细胞与FITC-缀合的山羊抗兔二抗2小时。
13. 在PBS中，室温洗涤细胞三次，每次5分钟
14. 通过倒置荧光显微镜观察图像细胞（图3和图4）注意：只有第二抗体作为阴性对照添加。
  
  图3.培养3周后，纯化的原代星形胶质细胞中S100-β抗原的表达。A.原代星形胶质细胞表达S100-β的星形胶质细胞抗原（阴性对照）;在具有10倍物镜（B）和40倍物镜（C），比例尺=50μm（B），100μm（C）的倒置荧光显微镜下观察到原代星形胶质细胞的S100-β的星形胶质细胞抗原。
  
  图4.纯化的原代星形细胞培养物中纤连蛋白抗原的评估，以便在培养3周后观察成纤维细胞污染。 A.在阴性对照中未观察到纤连蛋白的成纤维细胞抗原。用相差显微镜观察原发性星形胶质细胞，比例尺= 100μm。原发性星形细胞培养中未观察到纤连蛋白的成纤维细胞抗原

数据分析

通过荧光免疫细胞化学分析检测标记S100-β，进行培养的原代星形胶质细胞的确认。该分析表明，胶质母细胞瘤分离的细胞表达S100-β抗原。因此，该方案对于分离纯化的星形胶质细胞群是有效的。测试结果从三个独立实验中获得。

笔记

病理结果应确认患者肿瘤标本为多形性胶质母细胞瘤。
将含有5ml冷HBSS和10％抗生素抗真菌剂的15ml Falcon管保存在冰箱中，并将成胶质细胞瘤样品在手术后转移到管中。然后，将含有HBSS，10％抗生素 - 抗真菌和成胶质细胞瘤样品的管转移到干冰上的实验室。
冷冻胶质母细胞瘤样品不能用于分离原代细胞培养。我们检查了几个冻结的样品，我们不能从这些冷冻样品中获得原始星形胶质细胞。所以样品必须是新鲜的。而来自新鲜样品的原发性星形胶质细胞具有抗冻融耐受性
大多数步骤应在无菌通风罩中进行。
程序B-E中使用的所有试剂应在37℃预热，然后再使用。异常是用冷PBS洗涤和切碎组织。
胰蛋白酶的量直接取决于成胶质细胞瘤的样品量。根据表2增加大肿瘤样本的胰蛋白酶体积。

表2.样品直径与胰蛋白酶体积之间的关系

直径（毫米）
胰蛋白酶体积（毫升）

5
1

10
2

15
3

20
4
长时间和剧烈的机械解离降低细胞活力（存活率和生长）。原代细胞是敏感的。
我们在这种方法中不使用任何生长因子，FBS是培养基中的营养物质。
胶质母细胞瘤具有丰富的血管。血管可以将成纤维细胞转移到培养物中。根据该方案，如果将胎牛血清逐渐培养，成纤维细胞不能附着在培养瓶的底部。最后，可以增加成胶质细胞瘤分离的星形胶质细胞的纯度。

食谱

培养基（200 ml）
178 ml DMEM/F12
20毫升FBS
2 ml Pen/Strep
储存于4°C
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（500 ml）
将500ml MiliQ水溶解1片PBS 过滤灭菌并在4℃下储存
4％多聚甲醛
将4g多聚甲醛溶解于100ml PBS中
0.2％Triton X-100
在5ml PBS中加入10μlTriton X-100
10％牛血清白蛋白将0.5 g牛血清白蛋白溶解在5ml PBS中

致谢

这项研究得到了医学先进技术学院授予的20035年资助，并授予了德黑兰医科大学脑脊髓损伤研究中心19925年。该协议由Hashemi等人采用。（2016）。

参考文献

Hashemi，M.，Fallah，A.，Aghayan，HR，Arjmand，B.，Yazdani，N.，Verdi，J.，Ghodsi，SM，Miri，SM and Hadjighassem，MR（2016）。多形态成胶质细胞瘤基因治疗的新方法：人类嗅鞘细胞作为新载体用于自杀基因递送。 Mol Neurobiol 53（8）：5118-5128。
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