材料和试剂

12孔微孔板（Corning，Costar ^{®，目录号：3513）}
显微镜幻灯片76 x 26 x 1.1 mm（RS组件，目录号：ISO 8037）
显微镜盖玻片22 x 60 mm（Thermo Fisher Scientific，Menzel-Gläser，目录号：630-2102）
观察室Lab-Tek II Chambered Coverglass W/Cover＃1.5硼硅酸盐（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：155360）
海峡手术刀片（例如，，Swann Morton，直升安装BS EN 27740刀片）
拟南芥，野生型基因型的4至7天龄的幼苗，或表达膜和/或细胞板定位的荧光融合蛋白（例如， 2-p35S :: MP：YFP 在Col-0中，其中MP是肉豆蔻酰化和棕榈酰化信号序列[Martinièreet al。，2012; Simon等人。，2016]）。幼苗可以垂直生长在平板（90×90×15）或圆盘上，以获得完整的生长根
Murashige和Skoog（MS）培养基（Sigma-Aldrich，目录号：M5519）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A7921-1KG）
FM4-64（3-三乙基铵丙基）-4-（6-（4-（二乙基氨基）苯基）己三烯基）吡啶鎓二溴化物）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes < sup>，目录号：T-3166）
用于注册的合适的荧光染料（替代品）或荧光蛋白
1. 血浆膜或细胞壁染料如FM4-64或碘化丙锭（Sigma-Aldrich，目录号：P4864）
2. 核染料如Hoechst（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：H21486）
注意：注册步骤包括分析两个连续的图像，并使用相对位置注册（此后称为注册）叠加它们。为了注册，ImageJ需要在两个图像中找到共同的特征。因此，需要在一个通道中成像一段时间相对稳定的荧光染色。这将允许imageJ插件Turboreg比较两个连续的图像并适应位移（见注1）。作为具有易识别特征的稳定荧光标记物，我们成功地使用了：1）质膜局部荧光蛋白如肉豆蔻酰化和棕榈酰化YFP（Martinièreet al。，2012; Simon et al。，2016）或重要的质膜染料如FM4 -64（或者，可以使用其它染料如碘化丙锭[Sigma-Aldrich，目录号：P4864]），和2）核定位荧光蛋白如H2B-RFP（Federici等，2012; Larrieu et al。，2015）或重要的核染料如Hoechst（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：H21486）。然而，可以使用任何其他荧光蛋白质或染料，只要它在一段时间内标记稳定的结构，并且在延时获取过程中是稳定的（见注2）。

设备

装配有旋转盘模块（例如，，横河电机，型号：CSU-W1 [T3]的倒车共焦显微镜（例如，卡尔蔡司，型号：AxioObserver Z1）模型]）
连接显微镜的计算机上的Metamorph和ImageJ软件
20℃的植物生长室，具有24小时日光（例如，三洋电机，型号：MLR-351）
小镊子（例如，直镊子）
无菌罩

软件

ImageJ（ https://imagej.nih.gov/ij/;使用插件Turboreg（P.Thévenaz， http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/）和Stackreg（P.Thévenaz， http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）需要安装斐济（ http://fiji.sc/; Schindelin等人< em>。，2012）可以用来代替ImageJ，因为它捆绑了所需的插件。要添加插件，只需将其下载并复制到ImageJ/plugins文件夹中即可。
下载作为zip文件（名为Files_BioProtocol_Doumane）的三个文件（CL_ini-P-Ch-finished.JNL; CL_ini-Pos-Ch.JNL; CL-root-track-MM_63multiD.ijm），也可以在此url http://www.ens-lyon.fr/RDP/SiCE/METHODS.html ），并将其解压缩到C：\ MM \ app \ mmproc \ journal \ root-tracking \文件夹中。应根据所使用目标的校准编辑ImageJ宏文件CL-root-track-MM_63multiD.ijm。在ImageJ中打开文件（使用菜单Open> File ...），搜索带有"objective"的行，并将这个行和下一行的像素的实际大小（以微米为单位）替换为0.2063使用我们的63x物镜，1像素宽0.2063微米;图1;注5）。保存文件。通过在插件>中选择宏来安装宏宏>安装。 CL-root-track-MM_63multiD应该出现在插件>宏>>下图（使用63x物镜）。

图1.斐济编辑器中的宏文件.ijm。将显示器上像素的实际大小（以微米为单位）替换为数字0.2063（第81和82行），目标是将被使用。

程序

用生物染料染色的拟南芥生长的自然成像（见视频1和图2）

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视频1.准备用于FM4-64染色的Lab-Tek ^®观察室。将5μl100毫克/毫升的3毫升1/2 MS-0.8％琼脂FM4-64在Lab-Tek ^®观察室。

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图2.用于FM4-64染色的Lab-Tek ^{®观察室的制备A.将5μl的100mg/ml FM4-64滴入观察室; B.加入3ml预加热的½MS-0.8％琼脂; C.轻轻混合均质;让我们冷静下来，巩固。

在FM4-64浴（1μg/ml的FM4-64液体½MS）中培育幼苗5至10分钟（制备Lab-Tek观察室所需的时间）。

在Lab-Tek ^®观察室中准备½MS-0.8％琼脂FM4-64（参见食谱部分和视频2和图3）。当幼苗在FM4-64浴中孵育时，在Lab-Tek ^®室中倒入1/2 MS-0.8％琼脂FM4-64，等到固化并干燥。

<！ - flashid2245v216开始 - > 视频2.将幼苗转移到观察室中。切下一块1/2 MS琼脂，加入1/2 MS，然后放回½MS琼脂平方厘米。继续进行观察（FM4-64染色）或让其在生长室中放置数小时，以使幼苗适应于Lab-Tek ^®。

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图3.在观察室中转移幼苗。如果在没有FM4-64的情况下工作，请在面板（C）开始步骤。在这种情况下，更喜欢在无菌条件下工作。 A.以1μg/ml终浓度制备½MS-FM4-64的溶液; B.将幼苗转移到溶液中孵育5分钟; C.同时，在Lab-Tek ^®观察室中切下一块平方的琼脂块; D.然后用盖玻片将其从室中取出; E.在室内留下的孔中加入200μl的½MS; F.将幼苗转移到Lab-Tek ^®观察室。如果您计划将Lab-Tek ^®观察室放置在生长室中（无FM4-64工作时），确保幼苗大致对齐。 G.将琼脂块放回Lab-Tek ^®室内，放在整个幼苗上，或者仅在根系中。 H.用手套指尖轻轻追一下气泡;一，幼苗准备观察或一夜之间种植。

在室内切成琼脂平方面。琼脂片应该从室的一侧到另一侧，并且与盖玻片一样宽（20×24mm）。使用盖玻片，从观察室中取出琼脂块，并将其放在一边以备后用（参见步骤A6）。

将200μl液体½MS倒入离开琼脂块的孔中。

仔细对准Lab-Tek ^®观察室中的4个幼苗。

将½MS-agar-FM4-64的立方放在幼苗的顶部，手动追逐气泡（轻轻用手套指尖）。

将样品放在显微镜下。在显微镜下通过直接明场观察找到第一根根尖。

转到步骤B8。}
表达荧光蛋白的拟南芥生长的自动成像（参见Naramoto等人，2015; Aki和梅田，2016年详细的替代程序）

在无菌罩下，在观察室中倒入3ml预加热的1/2 MS-0.8％琼脂，使其冷却。

使用手术刀从室的一侧切割成平方的琼脂区域（20×24mm），并且与盖玻片一样宽。使用盖玻片从观察室中取出琼脂，并将其放在一边供以后使用（参见步骤B5）。

将200μl液体½MS倒入离开琼脂块的孔中。

仔细对准观察室中的4棵幼苗。

轻轻地将½MS-0.8％琼脂FM4-64的立方放在幼苗顶部。整个小/幼苗可以位于琼脂块和腔室底部之间。对于较长/较老的幼苗，只有根系可以位于琼脂和底部之间，幼苗的地上部分从琼脂中升出。手动追逐气泡，轻轻用手套指尖。

让植物在新的环境中生长，倾斜角度为±70°，在生长室过夜，使幼苗适应观察室，并保持增长。

将样品放在显微镜下。在显微镜下通过明场观察找到第一根根尖。

在Metamorph中，使用菜单'Apps'> "多维采集"（MDA）。

在"主"选项卡中，选择维度"Timelapse"，"多级位置"，"多波长"（即使只有一个位置和/或一个通道）和"运行日志"。这些模式是必需的。如果需要，也可以使用"Z系列"和"流"选项（图4）：这些模式是可选的，但彼此兼容。

图4.多尺度采集主选项卡：需要Timelapse，多级位置（即使只有一个），多波长（甚至只有一个）和运行日志。 Z系列和Stream是可选的。

选择一个空文件夹来保存图像。您不得在图像的基本名称中使用"_w"或"_s"。

根据需要更改MDA菜单中所选选项卡的其他设置（使用与常规延时采集相同的设置）：可以使用图5中显示的设置作为起点。如果您使用"Z系列"选项，请确保记住应该用于注册的切片编号（大部分时间使用堆叠的中心切片）;

图5.我们经常用于MDA模块选项卡的设置示例。在Z系列中，确保记住E中的步数（这里为121）：如果你想要使用中央切片进行注册，您需要在步骤B15中使用第60号"用于注册的切片"。

在"日记"菜单中，选择"结束阶段位置"的"CL_ini-Pos-Ch.jnl"，"收购结束"，"CL_ini-P-Ch-finished.jnl"，"CL_ini-Pos-Ch- done.jnl'为'取消'（图6）。

图6."多维采集日志"选项卡。为每个类别选择适当的日志。

您应该将MDA的设置保存在下一次的文件（主选项卡中的"保存状态..."）中。不要用Metamorph开始收购。

启动ImageJ/Fiji并运行宏CL-root-track-MM_63multiD.ijm。

一个窗口弹出。填写"位置数"（如MDA，1或更多），"用于注册的通道"（MDA中的通道号，1或更多）和"用于注册的切片"（如所述在步骤B11;图7）

图7.根据MDA模块中选择的设置，使用相应的数字填充宏弹出窗口。下面是与图5兼容的示例。

另一个窗口弹出。选择MDA中使用的文件夹来保存图像。

不要关闭ImageJ或其任何打开的窗口。回到Metamorph。选择菜单'日志'> "日记帐控制"> '秒表'：让新窗口打开。

通过MDA中的"Acquire"按钮开始采集（见注4）。

数据分析

制作电影后，您可以随时间获得稳定的影像（视频3）。

<！ - flashid2245v217开始 - >

视频3.使用自动根跟踪获得的视频示例。 1小时18分钟表达CENH3-RFP的幼苗根尖18分钟（Simon等人，2016年））。颜色由信号强度（最小黑/蓝，最大黄/白）编码

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笔记

您可以检查X和Y坐标是否改变每个根的加班时间，以确保注册正在发生。应从第三个时间点观察位置变化。

用于相对位置配准的染料的适用性可以通过短时间的定时延时采集（例如，，3-5个时间点进行测试，无需实时跟踪）：如果插件Stackreg可以要正确注册此次采集的片段，我们可以认为染料是合适的。这也是测试正确使用时间间隔进行延时采集的好方法。

如果要进行长时间推移分析（例如，4-24小时），最好在层流罩下的无菌条件下工作。对于短时间的丢失，这是可选的。

在收购结束时，您将有图像或堆叠，根本看起来几乎是静止的（如果根的运动不够线性，则可能需要注册后采集）。您将找到一个csv文件，其中记录为日志的阶段位移（以微米为单位），如果要测量图像中对象的速度，或者需要对进程进行故障排除，则需要该文件。如果在采集过程中出现ImageJ问题，Metamorph将继续进行采集，并将在下一个时间点使用X和Y中的最后计算的位移（在csv文件中不会记录附加坐标）。 />

该协议已经在我们的显微镜上进行了测试，目标范围从10x到63x。但是，只要宏文件按"软件"部分的第2段所述进行编辑，这个因素就没有限制。

食谱

FM4-64库存解决方案

将FM4-64粉末重悬在无菌蒸馏水中，制成100毫克/毫升的储备溶液（加入100微升无菌蒸馏水至100微克FM4-64粉末）

FM4-64可以在-20°C的光照条件下作为粉末储存，最多可在-20℃下以100 mg/ml的速度储存3个月

½MS-FM4-64浴

在12孔微量培养板中，将稀释的FM4-64储备溶液稀释至1毫升半强度MS（½MS）中的1μg/ml终浓度

轻轻混合

具有½MS-0.8％琼脂FM4-64染料的Lab-Tek ^®腔（见视频2）

准备½MS-0.8-％琼脂培养基，让其冷却至±60°C

在无菌罩下，在观察室中放入5μl的FM4-64储备溶液（见注3）

加入3 ml½MS-0.8％琼脂培养基，轻轻混匀

让它冷却，直到它固化

致谢

我们感谢Laia Armengot博士和Antoine Larrieu博士对手稿的批评性评论。 M.D.由法国高等教育研究部的研究员资助，由ERC编号3363360-APPL根据FP/2007-2013，M-C.C由集团领导人从ENS里昂开始包装«fond de recherche»的Y.J.。

参考文献

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