材料和试剂

ViewPlate-96黑色测定板（PerkinElmer，目录号：6005225）
重组人类hepsin蛋白（R& D Systems，目录号：4776-SE-010）
DMSO（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
荧光肽底物Boc-Gln-Arg-Arg-AMC（Bachem，目录号：I-1655.0025）
小分子化合物购自Asinex Corporation（Winston-Salem，NC， http：//www .asinex.com ）或MolPort（拉脱维亚里加， https： //www.molport.com/shop/index ）
WX-UK1是Ramachandra博士（Aurigene Discovery Technologies Limited，Bangalore，India）的一种礼物，但是它也可以商购（例如，AURUM Pharmatech，目录号：Z-3200）
Trizma碱（Tris）（Sigma-Aldrich目录号：T1503）
氯化钙（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：499609）
Brij-35（Brij L23 30％H 2 O溶液）（Sigma-Aldrich，目录号：B4184）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：31434-M）
重组人类hepsin蛋白的活化缓冲液（见配方）
重组人hepsin蛋白的测定缓冲液（参见食谱）

设备

ELISA板阅读器FLUOstar Omega（BMG LABTECH，型号：FLUOstar Omega）
电脑硬件由CSC提供 - IT中心科技有限公司（芬兰埃斯波）

HP Proliant SL230s（Hewlett Packard Development Company，型号：SL230s）
英特尔至强E5-2670 2.6GHz前瞻（100核，每个内核16 GB内存）（英特尔公司，型号：E5-2670）

软件

建模软件
使用蛋白质制备向导（Sastry等人，2013）的SchrödingerSuite（Schrödinger，LLC，New York，NY）），LigPrep，MacroModel和Glide（Friesner等人， 2004和2006; Halgren等人，2004）模块和协议版本2016-2（ https://www.schrodinger.com/suites/small-molecule-drug-discovery-suite ）
数据库

筛选和验证：ZINC数据库（可通过 http://zinc15.docking.org/）。 ZINC数据库包含超过1亿种3D格式的购买化合物（Sterling and Irwin，2015）
蛋白质结构数据库（ http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do ）

程序

用于虚拟筛选的靶蛋白结构的制备
hepsin蛋白质结构（PDB id 10E，来自蛋白质结构数据库， www.rcsb.org ，请参阅"在线工具"）可以使用"生物单位"选项自动下载薛定with with with with with with。。。。。。。。。。使用其他软件，应使用手动下载，并以软件首选方式读取结构。除了保留所有的水分子之外，使用默认方法进行预处理。应使用默认pH值7进行H键精制。所有具有至少3个非水原子H键的水分子都被保存，整个结构在默认设置下被最小化，重原子会聚在RMSD0.3Å。 Glide Grid文件使用上述结构创建，Grid的中心位于Tyr94（图2）。 GRID的中心是指GRID创建期间分子场计算的中心。 Tyr94，Tyr146，Ser195和Tyr228的羟基被允许旋转以进行网格生成。增加自由可旋转键可以将Glide计算时间增加一倍，并应将其计算时间保持在合理的水平。此外，强烈建议，如果可能，将构造Glide Grid文件，以便使用OPLS3强制字段。如果使用另一种软件，应使用相应的蛋白质制备方法。关键点是确保检查蛋白质的结构质量，使用极性侧链固定正确的电离状态，并使用（psuedo）对称残基的右旋转异构体。

图2.用于对接的GRID区域的定义。 GRID的中心基于残留TYR94，TYR146和SER195（残留标记的残基）的位置，GRIF区域以品红色框显示。
虚拟筛选化合物库的准备工作
虚拟筛选对象库必须使用虚拟筛选软件的作者推荐的方法和设置进行准备。当选择虚拟化合物库时，应考虑到用于筛选的化合物的量，自身合成的可能性，并且如果所得到的命中旨在如此使用或在随后的药物化学程序中进一步修饰。我们使用ZINC库的药物样子集，从ZINC网页下载为SDF文件。 SDF文件格式由所有主要的软件品牌支持。 SDF文件由SchrödingerLigPrep模块准备，具有默认设置（图3）。简而言之，准备工作包括检查2D结构质量，快速2D-3D转化，质子化状态的分析和修改，所有可达互变异构体的修饰以及进一步最小化所得分子。在典型情况下，每个分子将用2-4种不同的电离/原子/互变异构体状态表示。对于除Schrödinger软件以外的软件，我们建议通过LigPrep进行配置设置。根据我们自己的经验，这种方法的好处是它可以产生电离状态（即，pKa）以及互变异构体的高质量预测。大多数其他软件包中不包括互变异构体选项的预测。

图3.SchrödingerSuite下的LigPrep窗口。虚拟筛选库根据所选的设置进行准备;所示的设置是我们协议中的默认设置。
虚拟筛选和分析结果
在我们的研究（Tervonen等人，2016）中，虚拟筛选进行如下：
1. 使用上面定义的网格文件执行SP对接，最好的10％的化合物将用XP设置进行更新。
2. 聚类化合物最初通过视觉研究所得到的对接姿势进行。
3. 然后使用Schrödinger中提供的Interaction Fingerpint脚本对化合物进行聚类。
4. 结果造成了24个群集。
5. 在每个簇中，最具代表性的化合物位于簇的中心。选择这些化合物用于体外测定。
通过体外实验验证筛选结果无细胞肽裂解测定用于hepsin酶活性方案
1. 重组人hepsin（rhHepsin）在活化缓冲液中稀释至100μg/ml
2. 通过将溶液在37℃下孵育24小时来激活rhHepsin
3. 在使用前，用测定缓冲液将rhHepsin稀释成0.1nM溶液。
4. 将小分子化合物溶于DMSO中，得到10mM储备溶液
5. 测定在96孔板中的测定缓冲液中进行
6. 在100μl反应体积中将0.1nM终浓度的rhHepsin和10μM终浓度的小分子化合物（和等体积的DMSO对照）在室温下孵育30分钟。分析缓冲区用作空白控制。
7. 通过加入终浓度为30μM肽底物BOC-Gln-Arg-Arg-AMC开始反应。
8. 通过350nm激发和450nm发射捕获在室温下用ELISA板读数器分析板。
9. 抑制％通过使用以下公式确定：

数据分析

描述的虚拟筛选协议导致了数百个潜在的命中。使用上述协议和Tervonen等人。（2016），我们进行了一个初始的体外无细胞验证。通过三次技术重复和两次重复，相对于DMSO对照，肽切割的减少30％被认为是命中的截止值。我们订购并测试了通过虚拟筛选鉴定的24种化合物作为潜在命中（图1B），并且少量化合物使其接近截止值（参见Tervonen等人。这些化合物被用作下一轮虚拟筛选的骨架，这是一个重复的过程。在Tervonen等人的研究中。（2016），我们选择使用在平行屏幕上鉴定的WX-UK1，因为与其他测试分子相比，它与hepsin的结合姿势和极好的抑制效率。

笔记

电脑硬件
除了上面列出的硬件之外，我们还注意到，任何具有任何主要操作系统（Windows，Mac或Linux）以及Intel或AMD处理器的高端PC计算机都适用于虚拟筛选工作，但该过程将需要更多时间。
小分子化合物
我们注意到，虽然项目的虚拟筛选阶段是低成本和非耗时的，但筛选的一个瓶颈是化合物的价格。市售化合物的典型价格从50欧元到200欧元/毫克。因此，在无细胞测定中筛选数百种化合物将是项目中最昂贵的阶段。此外，大多数化合物以最小1mg包装尺寸（合成限度）出售，并且初始无细胞筛选仅需要该部分的量使得购买大量化合物不合理。
虚拟筛选的可行性在我们的经验中
虚拟筛选作为用于鉴定分子工具化合物的方法，在发现一小组骨架化合物方面表现良好，即使通过分子建模鉴定为命中的相对较少数量的化合物最终在体外测试（无细胞用重组hepsin进行测定）。这些结果表明，虚拟筛选原则上是鉴定跨膜丝氨酸蛋白酶抑制剂的可行方法，但建议使用虚拟筛选与其他方法结合使用。例如，从具有先前对目的的跨膜丝氨酸蛋白酶具有抑制作用或与密切相关的丝氨酸蛋白酶具有抑制作用的骨架化合物开始。这里描述的虚拟筛选策略将极大地促进了购买仅一个小微克数量的候选分子而不是毫克的可能性。任何合同研究实验室都将有一个重要的市场，能够将复合合成小型化，以便以低成本测试大量虚拟筛选命中。

食谱

重组人类hepsin（pH 8.0）的活化缓冲液
0.1 M Tris
10mM CaCl 2
0.15 M NaCl
0.05％Brij-35
重组人hepsin（pH 9.0）的测定缓冲液 50 mM Tris

致谢

协议是从Tervonen等人改编而来的。（2016）。这项研究由芬兰科学院，SigridJusélius基金会，芬兰癌症协会，赫尔辛基大学中央医院研究基金，Jane和Aatos Erkko基金会以及赫尔辛基生物技术与分子生物学和创新药物倡议联合承诺研究生计划授予协议No.115188。

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