材料和试剂

（Greiner Bio One International，目录号：188271）
100毫米TC处理的细胞培养皿（Corning，Falcon ^{®，目录号：353003）}
1.5毫升管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
24孔板（Corning，Costar ^®，目录号：3524）
T75烧瓶（VWR，目录号：734-0050）
48孔板（Corning，Costar ^®，目录号：3548）
10ml注射器（BD，目录号：309604）
具有0.22μm孔径的无菌注射器过滤器（EMD Millipore，目录号：SLGP033RB）
一次性HSW FINE-JECT ^®针（Henke Sass Wolf，目录号：4710004012）
移液器Gilson（10μl，20μl，100μl，1,000μl，5 ml）
微量吸头（VWR，目录号：89368-994）
显微镜盖眼镜：方格（Fisher Scientific，目录号：S175222）
粘合片，MenzelGläser，SuperFrost ^® Plus（VWR，目录号：631-9483）
HUVEC（人脐带血管内皮细胞）（Lonza，目录号：CC-2519或根据Baudin等人，2007）HUVEC的自我分离
隔离血管周围细胞/周细胞（PVC）（见注1）
AnxA5-LacZ小鼠（Anxa5 ^tm1Epo）（Brachvogel等人，2003）
胶原酶II型（Worthington Biochemical，目录号：LS004176）
DNase I重组（Roche Diagnostics，目录号：04536282001）
荧光素二（β-D-吡喃半乳糖苷）（FDG）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：F1179）}
碘化丙啶（PI）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：P3566）}
Dulbecco改性Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：31966021）}
胎牛血清（FCS）（Biochrom，目录号：S 0115）
青霉素 - 链霉素（P/S）（10,000U/ml）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
来自猪皮的明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G2500）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（EMD Millipore，目录号：1.6329.1000）
鼠尾型I型胶原溶液（Corning，目录号：354236）
氢氧化钠（NaOH）（VWR，目录号：28244.295）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：18912014）}
胰蛋白酶/EDTA（Biochrom，目录号：L 2153）
内皮生长培养基2（EGM2）（PromoCell，目录号：C-22111）
重组VEGF-A /血管内皮生长因子（Biomol，目录号：94900）
重组PDGF /血小板衍生生长因子-BB（Biomol，目录号：94968）
抗坏血酸磷酸盐（Sigma-Aldrich，目录号：A8960-5G）
甲醇（VWR，目录号：20903.461）
二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418-100ML）
吐温-20（Sigma-Aldrich，目录号：P1379-500ML）
牛血清白蛋白（BSA）（SERVA Electrophoresis，目录号：11930.03）
抗人CD31（BD，BD Biosciences，目录号：555444）
抗NG2-蛋白聚糖（EMD Millipore，目录号：AB5320）
驴抗大鼠Ig，Cy2缀合（Jackson ImmunoResearch，目录号：712-225-150）
驴，抗兔Ig，Cy2缀合（Jackson ImmunoResearch，目录号：711-225-152）
驴，抗兔Ig，Cy5缀合（Jackson ImmunoResearch，目录号：711-175-152）
驴，抗山羊Ig，Cy2缀合（Jackson ImmunoResearch，目录号：705-225-147）
安装解决方案
CFSE（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：C1157）}
SNARF-1（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：S22801）}
MCDB-131培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10372019）}
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（ReliaTech，目录号：300-003）
表皮生长因子（EGF）（Biomol，目录号：97052）
胰岛素溶液人（Sigma-Aldrich，目录号：I9278）
肝素
氢化可的松
10x DMEM，10x Dulbecco改良Eagle's培养基（Sigma-Aldrich，目录号：D2429-100ML）
丙酮酸钠（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11360070）}
Trizma ^{®基质（Sigma-Aldrich，目录号：T1503）}
氯化钠（NaCl）（EMD Millipore，目录号：1064041000）
高压灭菌蒸馏H 2 O O
增殖介质（见食谱）
PVC培养基（参见食谱）
HUVEC培养基（见食谱）
2x中混合（见配方）
胶原蛋白溶液（参见食谱）
Tris缓冲盐水（TBS）（见食谱）

设备

离心机（Eppendorf，型号：5415 R）
血细胞计数器（LO-Laboroptik，型号：Neubauer-Improved）
CO 2细胞培养箱（Heraeus）
离心机Labofuge（Heraeus Sepatech，型号：Labofuge GL）
高压灭菌器
SteREO Lumar.V12（Zeiss，型号：SteREO Lumar.V12）
Axiovert 40 CFL（Zeiss，型号：Axiovert 40 CFL）
Axioplan 2（Zeiss，型号：Axioplan 2）
水浴（Köttermann）
涡旋搅拌机（科学工业）
倒置显微镜Eclipse TE2000-U（Nikon Instruments，型号：Eclipse TE2000-U）
荧光激活细胞分选（MoFlow，Cytomation）
生物安全柜LaminAir HB 2448（Heraeus，型号：LaminAir HB 2448）

软件

ImageJ（斐济）

程序

使用AnxA5-LacZ小鼠从脑膜分离的周细胞的原始方案
1. 准备约200毫升的5％FCS-PBS，并在冰上冷却100ml的5％FCS-PBS。
2. 从4-6个月大的AnxA5-LacZ小鼠中仔细分离大脑。在立体显微镜下解剖脑膜，并将其转移到冰上用5％FCS-PBS的15ml管中。收集几个脑膜，然后在4℃以400×g离心样品5分钟。
3. 吸出上清液并溶解在1.5-3.0ml的0.4％胶原酶II型中。在37℃下孵育样品60分钟轻微摇动。随后，在室温下以400×g离心5分钟消化组织。
4. 吸出上清并重新悬浮于1.5-3.0ml的2％胰蛋白酶/100U DNA酶I.然后，37℃下将消化的组织温育30分钟，轻微摇动。接下来，在室温下以400×g离心5分钟。
5. 将细胞沉淀重悬于5％FCS-PBS中，并通过100μm细胞过滤器过滤细胞悬液。之后，在室温下以400×g离心细胞悬浮5分钟
6. 吸出上清液并将细胞沉淀重悬于5％FCS-PBS中。通过使用血细胞计数器确定细胞数，然后在20μl5％FCS-PBS中溶解1×10 6个细胞，并将20μl细胞悬浮液分配到新的1.5ml管中。向20μl细胞悬浮液中加入20μl的2mM荧光素二（β-D-吡喃半乳糖苷）（FDG），并在37℃下孵育混合物75秒。向细胞中加入500μl冰冷的5％FCS-PBS，并在黑暗中在冰上孵育3小时。使用未染色的样品作为细胞分选的对照
7. 在室温下以400×g离心细胞悬浮液5分钟，并将细胞沉淀重新悬浮于500μl的5％FCS-PBS中。为了排除死细胞，加入碘化丙啶（终浓度1μg/ml）
8. 通过荧光激活细胞分选（MoFlow，Cytomation）对染色细胞进行分选，并收集碘化丙啶阴性和FDG阳性细胞。接下来，在明胶涂覆的24孔板上，将细胞在5％CO 2中的细胞培养物（见Recipes）中，每孔5×10 4个PI阴性/FDG阳性细胞， 2℃培养箱中37℃。每隔一天更换培养基，并扩大分离的细胞。
9. 初始扩增后，细胞在10％FCS和1％P/S的DMEM中培养。细胞应通过流式细胞术进一步表征。细胞对Sca-1，CD140b和α-SMA呈阳性，对于PECAM，CD45，CD34，F4/F80和c-kit为阴性。来自小鼠脑膜的分离的Anxa5-LacZ（+）PVC保留其血管周围细胞表型，并且可以在不经历衰老的情况下培养以进行多次传代（Brachvogel等人，2007）。
  注意：可以根据要求与个体研究者一起建立具有优异血管生成活性的成熟且良好表征的PVC细胞系，以与内皮细胞进行共培养实验（Zhou等人。，2016）。这消除了将细胞与小鼠脑脑膜隔离的需要。
胶原蛋白凝胶中PVC和HUVEC的共培养
1. 将0.1g明胶溶解在100g高压灭菌的蒸馏水（终浓度为0.1％）中，并将溶液在121℃下高压灭菌30分钟。然后，通过向培养皿中加入5ml 0.1％明胶溶液，用明胶涂覆100mm TC处理的细胞培养皿，并分配明胶溶液，直到整个100mm TC处理的细胞培养皿表面被完全覆盖。在37℃下孵育少于2小时后，抽吸残留的明胶溶液。随后，在室温下使用干盘。
2. 将HUVEC在37℃的5％CO 2湿度培养箱中的明胶包被的平板上在EGM2培养基（参见食谱）中培养。将细胞培养直至亚汇合（〜80％）并进一步传代（1:3稀释）。 HUVEC只用于早期通道（3-6段）。将PVC在T75烧瓶或10cm培养皿上用10％FCS和1％P/S（参见食谱）的DMEM培养，并扩增至约80％汇合（见注2和图1）。
  
  图1.培养的血管周围细胞（PVC）和具有不同细胞密度的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）。代表性的80％和100％融合（细胞密度）培养的PVC和HUVEC的相图。细胞密度在这种共培养实验中起重要作用，可影响管形成。酒吧= 100微米。
3. 准备10毫升2x中等混合物（见食谱）。因此，将0.38g NaHCO 3溶解在10ml高压釜蒸馏水（浓度0.45M）中，并将溶液无菌过滤后溶解。然后，在6.8ml（最终体积为10ml）的高压蒸馏蒸馏水中混合2ml 10x DMEM，200μl100x丙酮酸钠和1ml制备的0.45M NaHCO 3（终浓度为0.045M）H 2 O。解决方案应该在冰上冷却直到使用。
4. 对于4ml胶原溶液（参见食谱），混合2ml 2x中混合物，800μlFCS（终浓度20％），963μl8.3mg/ml大鼠尾型I型胶原（见注3）（终浓度2毫克/毫升）和23微升高压灭菌蒸馏的H 2 O在冰上。最后，用214μl0.1N NaOH中和I型胶原溶液，并将溶液pH调节至7.4。将制备的胶原蛋白溶液储存在冰上直至使用。
5. 用10ml PBS洗涤亚汇合培养的HUVEC和PVCs，并在37℃下用1-2ml胰蛋白酶/EDTA分离细胞5分钟。加入9ml EGM2培养基以停止反应，并将细胞收集在15ml管中
6. 在室温（RT）下以400×g离心细胞5分钟。吸出上清并将细胞沉淀重悬于5ml EGM2培养基中。加入10μl每个细胞悬液至血细胞计数器中，以确定细胞浓度
7. 对于单次培养，在新的15ml管中，在EGM2培养基中转移6.25×10 5个HUVEC或1.25×10 5个（见注4）。混合6.25×10 5个HUVEC和1.25×10 5个PVC，用于在新的15ml管中的2ml EGM2培养基中共培养（图2）。或者，可以使用不同的内皮细胞或血管周围细胞，但细胞的相对比例需要适应和测试。强烈推荐技术重复或一式三份。在室温下以400×g离心细胞悬浮液5分钟。
  
  图2.三维共培养测定的工作流程
8. 仔细清除所有培养基，并将细胞沉淀重悬于1ml胶原I型凝胶溶液中。在48孔板的每个孔中加入200μl，并在37℃下孵育60分钟，直到溶液变成凝胶。为了增加凝胶的均匀性，胶原蛋白I型凝胶溶液与细胞应适当混合，凝胶溶液在孔中均匀地受到干扰。尝试通过将凝胶溶液直接添加到孔的中心并通过小心移动48孔板来分布来防止溶液的不均匀分布。为了改善凝胶化，48孔板应在37℃的温室中预热
9. 60分钟后检查是否形成均匀的凝胶。否则孵育30分钟。胶凝后，仔细添加400μl补充有10 ng/ml VEGF，10 ng/ml PDGF和250μg/ml抗坏血酸磷酸盐的EGM2培养基，每个凝胶顶部。在这个阶段可能会为不同的实验条件添加其他生长因子或药物。
10. 在5％CO 2/2湿度培养箱中孵育3〜6天的凝胶（见附注6），每24小时拍摄图像（图3）或视频（3张图像/h）。我们使用10或20x目标拍摄网络图像（Zeiss SteREO Lumar.V12或Zeiss Axiovert 40 CFL）。可以使用更高的放大倍数，但凝胶的厚度可能阻碍图像的采集。每48小时应更换含有补充剂的EGM2培养基。
  
  图3.在三维胶原I型凝胶中单次和共培养HUVECs的管形成研究。96小时后，HUVEC在血管周围细胞中形成一种在I型胶原中稳定的管网络凝胶，而单培养HUVEC几个管。以20倍的目标采集代表性的相位图像。酒吧= 100微米。
免疫组织化学检测细胞外基质和细胞蛋白在三维文化中的应用
1. 用600μlPBS洗涤凝胶两次（见附注6）
2. 用400μl80％甲醇/20％DMSO（Dent固定剂）固定凝胶30分钟。
3. 用600μl50％甲醇/PBS在室温下再溶解凝胶1小时。取出溶液，加入600μl20％甲醇/PBS。接下来，在室温下将600μlPBS-T（PBS，0.1％吐温-20）洗涤凝胶1小时。
4. 吸入溶液，加入600μl10％FCS，5％BSA的PBS溶液2-4小时，以阻止非特异性抗体结合。
5. 取出小心的封闭溶液，并用稀释在封闭溶液（10％FCS，PBS中5％BSA）的150-300μl初级抗体孵育凝胶，在4℃下摇摆过夜摇匀。抗生素稀释液应先经验检验。
6. 用600μlTBS-T（0.1％吐温在TBS中）洗涤凝胶一小时。重复洗涤步骤六次。
7. 孵育样品与150-300μl萤光发色团缀合的二抗在封闭溶液中在黑暗中在室温下2-16小时。
8. 用600μlTBS-T（0.1％吐温在TBS中）洗涤凝胶一小时。然后重复洗涤步骤六次。
9. 使用27 G针小心地从孔壁上除去凝胶。使用5毫升的微量吸管技巧将凝胶转移到载玻片上。在凝胶顶部加入50μl安装溶液，并用玻璃盖玻片小心地安装样品。
10. 图像采用Zeiss Axioplan 2采用5x和63x目标和足够的滤镜组来分别获得概览和特写图像。为了在三维培养物中可视化HUVEC，可以用CD31免疫染色（图4A和4B），并且可以用NG2-PG（图4B）或α-SMA特异性抗体对PVC进行免疫染色。 CD31 ⁺ HUVEC的概述图像用于管形成分析。
  
  图4.与PVC共同培养，诱导人脐带静脉内皮细胞（HUVEC）的内皮管形成。 A.将HUVEC单独培养（单培养）或与PVC共培养在三维胶原蛋白I凝胶中。培养6天后，如步骤C所述，用人CD31染色三维胶原蛋白I凝胶。比例尺=500μM。 B.使用CD31和NG2蛋白聚糖（NG2-PG）特异性抗体对共培养HUVEC和PVC的免疫染色。显示了具有核染色（DAPI）的个体或合并图像。比例尺=100μm
用荧光染料（CFSE，SNARF-1）进行活细胞跟踪的细胞标记
1. 在室温下将CFSE或SNARF-1在DMSO中溶解至终浓度为5mM。使用荧光染料后，溶液可以等分并储存在-20°C。为了随后使用荧光染料，在室温下在黑暗中融化CFSE和SNARF-1染料。新鲜制备100ml 3％FCS-PBS溶液。在室温下储存25毫升，并在冰上冷却剩余的75毫升至少30分钟
2. 如所述分离HUVECs和PVC（参见步骤A3），并在15 ml管中收集细胞。使用血细胞计数器确定细胞数，然后在室温下以400×g离心细胞5分钟。
3. 将细胞沉淀物重悬于适量的3％FCS-PBS中至终浓度为每1ml 3％FCS-PBS 1×10 7个细胞。不要使用少于50μl的3％FCS-PBS溶液。
4. 在使用前，使用PBS制备0.5mM的CFSE和SNARF-1溶液。然后，使用细胞悬浮液进一步稀释CFSE或SNARF-1溶液（0.5mM）至终浓度为0.01mM。通常，将2μl0.5mM CFSE加入到100μl细胞悬浮液中。所有以下步骤均在黑暗中避免曝光。
5. 在涡旋混合器上以最大速度将HUVEC和PVC混合10秒。然后，将细胞悬浮液在水浴中孵育10分钟，预热至37℃，不摇动
6. 加入5ml冰冷的3％FCS-PBS以停止反应，并在4℃以400×g离心细胞5分钟。吸出上清液并将沉淀重悬于5ml冰冷的3％FCS-PBS中。在4℃下以400×g离心细胞5分钟。离心后，吸出上清并再次沉淀在5ml冰冷的3％FCS-PBS中。离心细胞悬浮液在4℃下以400×g的速度再静置5分钟
7. 将细胞重悬在适量的EGM2培养物中，并进行步骤A4。在后续步骤和图像中减少曝光（图5）应在倒置的显微镜Eclipse TE2000-U（Nikon）或SteREO Lumar.V12（Zeiss）上进行。在这里，一个20x的目标被用于可视化。对于每个图像，拍摄相关通道（例如，用于CFSE标记细胞的Fitc通道）的相位对比度和荧光图像。 SNARF-1通常用于检测初始管形成（胶凝后几小时）。后来的SNARF-1标签难以检测。该系统可用于在初始血管生成步骤期间跟踪血管内细胞向内皮细胞的募集
  
  图5.人脐带静脉内皮细胞（HUVEC）和CFSE标记的血管周围细胞（PVC）的共培养，以三维条件跟踪血管周围细胞。如方法所述，将PVC用CFSE标记并随后与三维胶原I型凝胶共同培养HUVEC。培养72小时后，用20倍物镜拍摄相差图像和荧光图像。调整CFSE荧光和合并图像的亮度和对比度，以进行可视化。比例尺=100μm。

数据分析

ImageJ（斐济）用于图像分析。
打开感兴趣的图像文件（文件→打开→选择图像）。
设置刻度。在工具栏中选择"箭头工具"，并沿图像中的比例尺绘制箭头。接下来，单击分析→设置缩放以打开一个新窗口，其中根据从比例尺箭头获得的距离和单位长度来调整长度的已知距离和单位。之后，点击"确定"。
转到工具栏，双击"箭头工具"打开一个窗口。选择箭头的颜色，然后点击"添加到覆盖后保留"。接下来，点击"确定"
选择"箭头工具"，沿着管子绘制箭头。单击分析→测量（或STRG + M）打开一个"结果"窗口，其中包含此箭头的长度。要向图像添加箭头，请单击图像→覆盖→添加选择（或STRG + B）。
沿着下一个管绘制一个箭头，并按照步骤D5中所述测量长度。
一旦测量了所有的管子，用箭头保存图像（文件→另存为→TIFF）。
将数据从"结果"窗口传输到Excel电子表格中，并确定所有测量管长度的平均值。建议从两个或三个不同的图像采集测量。

笔记

通过各种分离程序分离的不同内皮细胞（商业供体）或血管周围细胞可用于共培养。在任何情况下，可能必须对单个实验优化单元格编号。
100％汇合培养物不应用于该测定，因为它影响管形成
大鼠尾巴I型胶原的浓度可以在不同批次中变化，体积必须调整。
没有相应调整的单元格编号可能会影响结果。
在每个图像中包括比例尺以进行定量。
小心地从凝胶中除去上清液而不接触。推荐这个步骤，而不是吸气。

食谱

增殖培养基
MCDB-131
5％FCS
10ng/ml表皮生长因子（EGF）
2ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）
5μg/ml胰岛素 5ng/ml血小板衍生生长因子-BB（PDGF-BB）
PVC培养基（DMEM，10％FCS，1％P/S）
445毫升DMEM
50 ml FCS
5 ml P/S
在37°C使用前的预热培养基
HUVEC培养基（EGM2与补品）
500毫升基础培养基
0.02 ml/ml FCS
5ng/ml表皮生长因子（EGF）
10 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）
20ng/ml胰岛素样生长因子（IGF）
0.5 ng/ml血管内皮生长因子（VEGF）
1μg/ml抗坏血酸
22.5μg/ml肝素 0.2μg/ml氢化可的松
注意：基础培养基应订购补充包，其中包括所有上述补品，其浓度正确。只有小的等分试样应该在37°C预热。
2x中混（最终体积10 ml）
2 ml 10x DMEM
0.2ml 100x丙酮酸钠
1ml 0.45M NaHCO 3
6.8毫升高压灭菌的蒸馏H 2 O 2/
胶原溶液（终体积4毫升）
2 ml 2x medium-mix
800μlFCS（终浓度20％）
963μl8.3 mg/ml大鼠尾型I型胶原溶液
214μl0.1 N NaOH 23升高压灭菌的蒸馏H 2 O 2/
在冰上准备解决方案，并保持在冰上直到使用
Tris缓冲盐水（TBS），pH 7.4
150 mM NaCl
50 mM Tris-HCl

致谢

在最近的两篇出版物（Pitzler等人，2016; Zhou等人，2016）中使用了三维共培养测定法。这项工作得到德意志民主共和国（DFG 2304/5-3,2304/7-1,2304/9-1）的支持。

参考文献

Baudin，B.，Bruneel，A.，Bosselut，N.和Vaubourdolle，M。（2007）。用于人脐静脉内皮细胞分离和培养的方案 Nat Protoc 2（3）：481-485。
Brachvogel，B.，Dikschas，J.，Moch，H.，Welzel，H.，von der Mark，K.，Hofmann，C.and Poschl，E。（2003）。 Annexin A5对于骨骼发育不是必需的。 Mol Cell Biol 23（8）：2907-2913。
Brachvogel，B.，Moch，H.，Pausch，F.，Schlotzer-Schrehardt，U.，Hofmann，C.，Hallmann，R.，von der Mark，K.，Winkler，T.and Poschl，）。表达膜联蛋白A5的血管周围细胞定义了一种小说间充质干细胞样群体，具有分化为多个间充质谱系的能力。 132（11）：2657-2668。
Brachvogel，B.，Pausch，F.，Farlie，P.，Gaipl，U.，Etich，J.，Zhou，Z.，Cameron，T.，von der Mark，K.，Bateman，JF和Poschl，（2007）。孤立的Anxa5 ^{+ 和体内。 > Exp Cell Res 313（12）：2730-2743。}
Pitzler，L.，Auler，M.，Probst，K.，Frie，C.，Bergmeier，V.，Holzer，T.，Belluoccio，D.，van den Bergen，J.，Etich，J.，Ehlen，H 。，Zhou，Z.，Bielke，W.，Poschl，E.，Paulsson，M.and Brachvogel，B.（2016）。 miR-126-3p促进基质依赖性血管周围细胞附着，迁移和细胞间相互作用。干细胞 34（5）：1297-1309。
Zhou，Z.，Pausch，F.，Schlotzer-Schrehardt，U.，Brachvogel，B.and Poschl，E。（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http： ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27038636"target ="_ blank">错误：诱导体外细胞血管生成分化和内皮细胞成熟的初始步骤和胶原蛋白IV的作用。 Histochem Cell Biol 145（5）：527-529。