材料和试剂

灭菌袋（Fisher Scientific，目录号：01-812-51）
100 x 20毫米 - 培养皿（康宁，目录号：430167）
6孔板（Corning，Falcon ^®，目录号：353046）
1.5ml Eppendorf管（USA Scientific，目录号：1615-5510）
0.22μm过滤器（EMD Millipore，目录号：SLGP033RS）
15 ml无菌管（VWR，目录号：89004-368）
1毫升移液器尖端
石蜡膜
10 ml血清移液管（Santa Cruz Buitechnology，目录号：sc-200281）
70微米过滤器（Fisher Scientific，目录号：22-363-548）
50ml无菌管（VWR，目录号：89004-364）
30μm过滤器（Milteny Biotech，目录号：130-041-407）
0.45μm过滤器（EMD Millipore，目录号：SLHV033RS）
24孔板（Corning，Falcon ^®，目录号：353047）
滑头注射器（BD，目录号：302833）
无菌细胞刮刀（Corning，Falcon ^®，目录号：353085）
成年老鼠（Mus musculus; 6-8周龄）（见注释7和8）
2,2,2-三溴乙醇（Avertin）（Sigma-Aldrich，目录号：T48402）
0.25％胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25200056）}
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10010023）}
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A2153）
一抗抗体Pax7（小鼠）（Developmental Studies Hybridoma Bank，catalog number：Pax7）
一抗抗体MyoD（兔）（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-304）
一抗抗体MyHC（小鼠）（Developmental Studies Hybridoma Bank，目录号：MF-20）
第二抗体山羊抗兔Alexa Fluor 488缀合物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-11034）
第二抗体山羊抗小鼠Alexa Fluor 568缀合物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：A-11004）
100％乙醇（Decon Labs，目录号：2701）
Matrigel（康宁，目录号：354234）
Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM）高葡萄糖，丙酮酸（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11995065）}
胶原酶II（Worthington Biochemical，目录号：LS004176）
超纯水（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：10977015）}
青霉素 - 链霉素（Pen/Strep）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）（1M）（Thermo Fisher Scientific，Gibco< sup>，目录号：15630080）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10437028）}
重组人成纤维细胞生长因子基因（bFGF）（PeproTech，目录号：100-18B）
Tris碱（Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
F-10营养混合物（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：11550043）}
Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（ATCC，目录号：30-2002）
马血清（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：26050088）
二甲基亚砜（DMSO）（Fisher Scientific，目录号：BP231-100）
多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
100％Triton X-100（Fisher Scientific，目录号：BP151-500）
4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（Sigma-Aldrich，目录号：D8417）
70％乙醇（见食谱）
10％Matrigel（见食谱）
胶原酶II（参见食谱）
消化培养基（参见食谱）
收集/洗涤/切碎溶液（参见食谱）
中和/隔离介质（见配方）
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（参见食谱）
成肌细胞生长培养基（MGM）（参见食谱）
后隔离洗涤介质（参见食谱）
分化培养基（DM）（参见食谱）
冷冻介质（参见食谱）
4％多聚甲醛（PFA）（见配方）
0.3％Triton X-100（参见食谱）
10％Triton X-100（见配方）
阻塞解决方案（见配方）
DAPI（见配方）

设备

高压釜
解剖工具：灭菌/高压灭菌剪刀和镊子
生物安全柜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：1300 Series II，A2型）}
用于1.5ml Eppendorf管的台式离心机（Eppendorf，型号：5424/5424 R）
用于15ml和50ml管的台式离心机（Eppendorf，型号：5702/5702 R/5702 RH）
加热培养箱振荡器（Eppendorf，New Brunswick ^TM，型号：Excella E24）
CO 2培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：3578）}
显微镜（Nikon Instruments，型号：Eclipse TE2000）
水浴（Thermo Fisher Scientific，型号：Isotemp ^{TM数字控制水浴：215型，目录号：15-462-15Q）}
500毫升瓶子

程序

分离和纯化小鼠后肢肌肉的原代成肌细胞的基本步骤如图1所示

图1.从小鼠后肢肌肉分离原代成肌细胞的一般程序的示意图。 MGM，成肌细胞生长培养基; FGF，成纤维细胞生长因子; DM，分化培养基。

在分离初级成肌细胞之前
1. 在每个包含一把小剪刀和镊子的灭菌袋中高压灭菌两套工具（见注1和2）。
2. 按照配方1，准备70％乙醇
3. 按照配方2，准备10％Matrigel（见注3）。
4. 按照方法3，制备胶原酶II（见附注4）
5. 按照配方4，准备消化培养基（见注5和6）
6. 按照配方5，准备收集/洗涤/切碎溶液。
7. 按照配方6，准备中和/隔离介质（见注5）
8. 按照方案8，准备成肌细胞生长培养基（MGM）（见注5）
9. 通过倾倒并铺展10％Matrigel溶液以覆盖板区域，将100×20mm培养皿（每只小鼠一个板）涂覆。避免气泡。 30秒后，除去过量的基质胶溶液（如果保持无菌，可以收集多余的10％Matrigel并重新使用多次重复使用）。在生物安全柜（约20分钟）内，将无盖帽放在无菌空气流中干燥。一旦干燥，将盖子放在板上，并在室温下离开无菌生物安全柜，直到准备使用。没有必要打开生物安全柜的紫外灯。该板将用于在用胶原酶消化肌肉后分离和培养成肌细胞。
10. 对于消化前的肌肉收集和洗涤，制备含有3ml /孔的收集/洗涤/切碎溶液的6孔板（只需要每只小鼠需要6孔板的4个孔）。
11. 对于分离后的肌肉切碎，每只小鼠准备两个1.5ml Eppendorf管，每个包含500μl收集/洗涤/切碎溶液。
肌肉清除和清洗
1. 在您的实验室中批准IACUC指南后，安乐死小鼠。为了该方案的目的，给予小鼠以250mg/kg的剂量腹膜内注射2,2,2-三溴乙醇，接着颈椎脱位。
2. 在生物安全柜外部进行从小鼠分离后肢肌肉。对于该步骤，除了高压灭菌的解剖工具和乙醇喷雾之外，不需要无菌技术。用70％乙醇喷洒后肢，将鼠标朝上。
3. 使用来自后肢的高压灭菌剪刀去除皮肤以暴露肌肉。
4. 使用第一对高压灭菌的剪刀和镊子，从一个后肢收集胫骨前，腓肠肌，比目鱼，四头肌和伸肌腱长肌，并将它们放入含有收集/洗涤/切碎溶液的6孔板的一个孔中（视频1 ）。
5. 在另一个后肢重复上一步，将肌肉放在含有收集/清洗/切碎溶液的6孔板的第二口中（见注9）。
6. 使用第二对高压灭菌镊子将肌肉转移到装有收集/洗涤/切碎溶液的6孔板的另外两个孔中。这是需要洗涤和去除孤立的肌肉上的任何粘着的头发或不想要的组织。
7. 将盖子放在含有肌肉和收集/洗涤/切碎溶液的6孔板上，并用70％乙醇喷雾，然后将板转移到无菌生物安全柜。从此步骤开始，所有程序必须在生物安全柜内执行，以避免肌纤维的潜在污染。
肌肉切碎/消化
1. 使用第二对高压灭菌的镊子将洗涤的肌肉转移到两个1.5ml Eppendorf管（每个后肢肌肉组一个管），其含有收集/洗涤/切碎溶液，并使用第二对高压灭菌剪刀非常精细地切碎肌肉（参见附注10）。 ;
2. 一旦肌肉被切碎，使用RTL离心机21,130 x g旋转30秒，将收集/洗涤/切碎溶液中的切碎的肌肉碎片分离。
3. 将无菌生物安全柜内的纺管放在一边。
4. 通过将1ml胶原酶II加入到先前制备的消化介质的基底中完成消化介质的制备（参见附注6）。使用0.22μm注射器过滤器将整个消化混合物过滤到15 ml管中
5. 从含有肌肉的Eppendorf管中取出上清（步骤C2）。
6. 将切碎的肌肉转移到消化培养基管中，切除无菌1 ml移液管尖端的尖端，以形成大孔以适应切碎的肌肉尺寸。
7. 将少量消化培养基转移到Eppendorf管中以重新切碎肌肉，然后将混合物（切碎的肌肉+消化培养基）转移到原始的15ml消化培养基管（步骤C4）中。
8. 重复步骤C7，直到所有切碎的肌肉从Eppendorf管转移到含有消化混合物的15ml管中。
9. 关闭含有切碎肌肉和消化介质的15 ml管的盖子，并用Parafilm包裹盖子，以避免任何潜在的渗漏。
10. 漩涡管5秒。
11. 将管子水平放置在37℃的振荡器中，并以100rpm的速度摇动1小时，再用另外5秒的涡旋中途穿过（见注11）。
12. 1小时后，混合应出现多云，肌肉块大部分消化很小（见附注12）
13. 一旦消化完成，涡流管含有消化的肌肉混合物5秒
14. 在室温下以1,400×g旋转管5分钟。
15. 在无菌生物安全柜内，取出上清（消化介质）并弃去
16. 使用10ml血清移液管将消化的肌肉沉淀重悬于7ml中和/分离培养基中。使用无菌10ml移液管将消化的肌肉组织颗粒上下移动20-30次。这确保大多数成肌细胞从肌肉组织释放。
17. 将70μm过滤器放在50ml管上
18. 用2 ml中和/隔离介质预先将70μm过滤器预湿。
19. 使用10ml血清移液器收集重悬肌肉丸混合物（步骤C16），并通过预湿70μm过滤器。
20. 用2ml中和/分离介质洗涤过滤器，以确保细胞粘附在过滤器上（在此步骤中大多数组织碎片将被除去）。
21. 在15 ml管中，用1 ml中和/分离培养基预湿30μm过滤器
22. 通过预湿30微米过滤器通过细胞混合物（先前通过70微米过滤器应变）。这一步将从成肌细胞中去除大的浸润细胞，如巨噬细胞
23. 用1ml中和/分离介质清洗过滤器，以确保细胞不会粘附在过滤器上
24. 含有细胞混合物的旋转管以1,400×g×5分钟。
25. 去除上清液（中和/分离培养基），并将细胞沉淀重悬于10ml MGM + bFGF中
26. 将细胞混合物种在10％Matrigel预涂的培养皿上。
27. 在显微镜下观察细胞。在这一步，肌肉颗粒和细胞将会有一个不均匀的混合物（图2）。
  
  图2.在不同纯化阶段初次成肌细胞培养物的代表性相差显微镜图像在（A）0h，（B）的10％Matrigel包被的培养皿中接种后过滤消化的肌肉混合物， 24小时，（C）72小时。（D）第一次预镀和（E）第二次预镀步骤后成肌细胞的外观。 F.在2-4次预镀步骤后，纯化成肌细胞培养物。刻度棒=20μm。蓝色箭头指向组织/细胞碎片;红色箭头指向成纤维细胞（大而扁平的三角形）;绿色箭头指向成肌细胞（圆形或双轴纺锤形）。
28. 将培养皿保持在37℃CO 2培养箱中72小时。在这个潜伏期间不要改变培养基。
29. 72小时后，除了残留的组织碎片外，您还应该可以看到粘附的，小的，液滴形的成肌细胞和大的三角形成纤维细胞。
30. 此时，电池已准备好进行第一次预镀（见附注13）。
成肌细胞纯化（预镀）
1. 从菜中取出培养基。
2. 使用10ml血清移液管，用后隔离培养基（含有1％Pen/Strep的F-10培养基）轻轻洗涤粘附细胞两次。
3. 通过加入2ml 0.25％胰蛋白酶-EDA并将细胞置于37℃在CO 2培养箱中2分钟来分离细胞。
4. 在显微镜下可视化，以确保所有细胞分离。
5. 一旦细胞分离，加入10ml MGM + bFGF到盘中（见附注14）
6. 将细胞混合物转移到非Matrigel包被的组织培养皿中，并在37℃在CO 2培养箱中放置45分钟。这将允许更大的细胞如成纤维细胞粘附在盘的底部，而大多数成肌细胞仍将悬浮在培养基中。
7. 在这段时间里，用上面描述的方法涂上10％Matrigel的新培养皿
8. 45分钟后，将所有上清液从预镀盘转移到新的Matrigel包被的培养皿中，并将盘放在CO 2培养箱中（见附注15）。
9. 预镀步骤应每36-48小时进行一次，直至>达到98％的成肌细胞纯度（见附注16）。图2C-2E给出了成肌细胞分离的各个步骤中的代表性的对比图像。纯化的成肌细胞培养物图像如图2F所示。
培养成肌细胞
1. 纯化的成肌细胞通过在成肌细胞生长培养基中孵育并每隔一天更换培养基而保持在培养物中。
2. 不允许单元格达到> 70％融合（除非实验需要），因为这将导致成肌细胞的成熟前分化和融合。
3. 根据需要将细胞分裂成多个10％Matrigel涂层的培养皿
4. 成肌细胞可以收集在冷冻介质中并像任何其他培养细胞一样储存在液氮罐或-80°C冰箱中。初级成肌细胞一旦解冻，维持其增殖和分化能力，再次培养
将初级成肌细胞分化为肌管
1. 具有类似于上述那些的10％Matrigel的涂层组织培养板
2. 预涂基质胶板中的原始成肌细胞。为了获得优质的肌管，成肌细胞在加入分化培养基（DM）之前应该达到85-95％的汇合度。对于6孔组织培养板，我们需要每孔0.75-0.9×10 6个细胞;然而，该数量将根据细胞通道数而变化。低通道细胞的大小通常较小，因此使用范围的较高端实现所需的融合，而较高的传代细胞的细胞尺寸更大并且尺寸较大，所以需要细胞数量的较低端（参见附注17）。 />
3. 第二天，用DM替代成肌细胞生长培养基（见附注18）。
4. DM应每48小时更换一次。
5. 成肌细胞在DM培养24-36小时内排列并融合。在48小时，可以清楚地看到小肌管，并且在72-96小时之间变得大而成熟
初级成肌细胞和肌管的免疫染色
1. 从含有原始成肌细胞或肌管的6孔组织培养板中取出培养基，这些培养板粘附在孔的表面。
2. 通过添加适量的4％PFA来覆盖细胞并孵育15分钟来固定粘附的细胞
3. 去除4％的PFA，并用1x PBS轻轻洗涤细胞三次，每次5分钟
4. 通过加入0.3％Triton X-100对细胞进行渗透，并在室温下孵育7分钟
5. 去除0.3％Triton X-100，并用PBS轻轻洗涤细胞3次，每次5分钟
6. 通过加入2％BSA溶液20分钟除去PBS并阻断细胞
7. 在封闭溶液中制备一抗抗体混合物。
  注意：我们使用1:10稀释的Pax7抗体，1:200稀释的MyoD和1:200稀释的MF-20（即MyHC）抗体。
8. 去除封闭溶液，并向每个孔中加入所需的一抗混合物
9. 用Parafilm包裹板以防止一抗溶液的蒸发。
10. 初级抗体孵育可以在室温下进行1-2小时，或在4℃下进行过夜。
11. 一旦初次抗体孵育期完成，取出一抗溶液，用PBS洗涤细胞三次，每次5分钟
12. 对于每个二级抗体，以1:1,500的浓度制备阻断溶液中的二抗混合物。
  注意：我们使用抗小鼠Alexa 568的红色荧光和抗兔Alexa 488进行绿色荧光。
13. 用Parafilm包裹板以防止二次抗体的蒸发。
14. 二次抗体孵育在室温下在黑暗中进行1小时
15. 移除二抗溶液，用PBS洗涤细胞三次，每次5分钟
16. 在PBS中准备DAPI工作解决方案。
17. 从孔中取出PBS，并加入用于染色核的DAPI溶液
18. DAPI孵育在黑暗中在室温下进行3分钟
19. 取出DAPI，用PBS洗涤细胞三次，每次5分钟。
20. 将PBS加入孔中。
21. 细胞现在可以在荧光显微镜下显现。用抗Pax7，抗MyoD和DAPI染色后的成肌细胞培养物的代表性图示于图3中。用抗MyHC和DAPI染色后的分化肌管培养物图像示于图4中。
  
  图3.用于Pax7和MyoD的原代成肌细胞培养物的染色将在MGM中生长的原代成肌细胞培养物固定并对Pax7和MyoD蛋白进行免疫染色。核用DAPI进行复染。在这里介绍代表性的个人抗Pax7，抗MyoD和DAPI染色和合并的图像（三重染色）。比例尺= 20μm
  
  图4.肌球蛋白重链（MyHC）的主要肌管培养物的染色。将初级成肌细胞在DM中孵育24小时或48小时。将培养物固定并用MyHC蛋白免疫染色。核用DAPI进行复染。在这里介绍代表性的个人反MyHC和DAPI染色和合并的图像。比例尺= 20μm

数据分析

对于个别实验，样品量应通过功率分析来确定。我们大多数研究集中在研究调节因子对成肌细胞增殖和分化的影响，我们在4-5次重复中进行实验。为了研究肌原性分化，我们计算肌成纤维指数，这是MyHC染色的肌管在板中总核中的核的百分比。我们将数据呈现为平均值±标准偏差（SD）。我们使用配对或不配对的Student's -test来确定不同组之间的统计差异，类似于（0gura等人，2015; Hindi和Kumar，2016）。 A 0.05被认为具有统计学意义。

笔记

所有步骤除了后肢肌肉的初始分离应在无菌条件下进行。即使从安乐死的小鼠中分离后肢肌肉，强烈推荐使用高压消毒的解剖工具和喷雾乙醇。
一套将用于从小鼠收集肌肉，而另一套将在无菌生物安全柜下使用，以转移和切断肌肉。
不要让100％Matrigel达到RT，因为这会使其凝固，并形成一种浓缩的凝胶，如难以在DMEM中稀释的材料。
在所有批次中，沃辛顿胶原酶的粉末原料不具有相同的活性（即，单位为mg干重）。因此，每次准备胶原酶原料时，请仔细阅读原料粉末小瓶中存在的活性
所有介质应在37°C使用前加温。
当肌肉切碎并准备消化时，胶原酶只能加入，因为提前加入胶原酶会削弱其消化活性。
要从成人卫星细胞获得原代成肌细胞，小鼠必须≥6周龄。
为了获得最佳的初级成肌细胞，小鼠不应该≥8周龄。如果实验设置需要，则可以对年轻或老年小鼠进行该方案，然而可观察到肌原性产量和纯度的一些改变;年轻的小鼠会产生更多的成肌细胞，因为它们的肌肉含有促进肌肉发育和生长的活跃的增殖细胞。另一方面，较老的或患病的小鼠可能产生较少的成肌细胞，具有较低的纯度和较高的成纤维细胞含量。当从基因小鼠模型或经受各种实验程序的小鼠分离原代成肌细胞时，应考虑到类似的考虑。
在两分钟内肌肉收集应在5分钟内进行，以保持活力。
确保肌肉在这一步中精细切碎，因为这会影响成肌细胞的产量。
在这一点上观察消化肌肉混合物的外观很重要。肌肉片应看起来较小，消化介质应开始出现多云。如果肌肉片非常小，那么将下半年的消化时间减少到20分钟。
如果肌肉块的尺寸仍然较大，似乎没有完全消化，则将消化时间延长10分钟或直到消化完成。
如果细胞密度在分离后72小时非常低，此时不要预片，只需用F-10 + 1％PS洗涤菜，再用新鲜的MGM + bFGF再喂。
bFGF以10ng/ml的浓度直接加入到培养皿中，或者可以以相似的浓度提前制备MGM + bFGF的混合物，但是如果适当地储存在4周时，这仅适用于1周°C。
有时，成肌细胞也会沉淀到预镀盘的底部，因此，如果大量的成肌细胞观察到重复预镀步骤较短的持续时间（约20分钟），那么第二天再加入培养基，。
通常可以通过进行1-4次电镀重复来实现高成肌细胞纯度，但在某些情况下，这是不够的。如果成肌细胞似乎没有越来越多地主导着每个预镀步骤的文化，那么可以解决一种替代的纯化策略：
1. 将您的文化分成多种培养皿，以便每道菜含有约10％融合的细胞混合物。
2. 每个单元格应与其相邻单元格空间分开显示。
3. 允许细胞持续生长，每隔一天更换米高梅。
4. 每天应该观察源自单细胞的成肌细胞集落的形成。您还将观察到源自单个细胞的成纤维细胞菌落的形成
5. 在倒置显微镜下，定位观察成纤维细胞集落的区域，并使用标记来标记该盘的底部。
6. 在无菌生物安全柜下，使用无菌细胞刮刀物理擦拭成纤维细胞集落（注16e中标示）。
7. 吸出培养基并用分离后的洗涤介质洗几次。
8. 在笔记16f和16g中刮去和洗去成纤维细胞菌落后剩下的细胞（应该是主要成肌细胞集落）留下胰蛋白酶化。
9. 将您的细胞置于新涂10％Matrigel菜中。
10. 应该观察到高成肌细胞纯度。
避免在电镀分化过程中过度拥挤细胞，因为这将限制成肌细胞在融合之前伸长所需的空间，并对细胞施加额外的压力，可能导致细胞死亡和缺陷的肌管形成。
如果细胞在第二天不处于最佳汇合处，允许细胞增殖更长以达到期望的汇合度，然后再切换到DM。

食谱

70％乙醇
将700ml 100％乙醇与300ml去离子水结合使用
10％Matrigel
1. 解冻Matrigel在冰过夜
2. 将10ml冷Matrigel溶于90 ml冷DMEM中
3. 将15 ml 10％Matrigel每15 ml无菌管分批成多个管，以供以后使用
4. 将10％Matrigel等分试样储存在-20°C长时间储存
5. 为了经常使用，将10％Matrigel管储存在4°C
注意：一旦从-20°C中取出并解冻，不要将10％Matrigel溶液重新冻结。
胶原酶II
1. 通过将胶原酶II溶解在浓度为4000 U/ml的超纯水中来制备原料
2. 将这种胶原酶II储备溶液分配到无菌Eppendorf管中的多个1ml等分试样中，以备以后使用
3. 在-20°C储存等分试样
4. 解冻胶原酶II即将使用前
注意：避免重复的冻融循环，因为这将降低胶原酶II的酶活性。
消化介质
10 ml消化培养基足以消化一只小鼠的后肢肌肉，如果使用较老的小鼠，可以修改体积。
10 ml：
1. 通过用100μlPen/Strep（1％）和250μlHEPES（2.5％）补充8.65ml DMEM（Gibco）来制备消化培养基。保持在37°C在水浴中直到准备使用
2. 一旦肌肉被分离，切碎并准备消化，加入胶原酶II使终浓度达到400 U/ml。手动握手
3. 过滤消解介质使用0.22μm过滤器
收集/洗涤/切碎溶液
对于15ml，将150μlPen/Strep与14.85ml 1x PBS组合以获得1％Pen/Strep在PBS中的溶液
中和/隔离介质
准备一个500毫升的中和介质：
1. 从500毫升瓶中取出50ml的DMEM（Gibco），并在4℃下储存以备以后使用
2. 将50ml过滤的FBS加入到现在含有450ml DMEM的DMEM瓶中，以达到10％FBS的浓度
3. 将5 ml Pen/Strep加入到上述混合物中，以达到1％Pen/Strep浓度
4. 将该库存存放在4°C
5. 使用前温度要求在37°C以上
碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）
1. 用0.1％BSA稀释50μgbFGF（50μg/ml）于1ml过滤灭菌的5mM Tris（pH 7.6）中的溶液。
2. 等分成小（50-100μl）并储存在-20°C或-80°C
3. 解冻等份立即使用前
注意：避免重复冻融循环。
成肌细胞生长培养基（MGM）
准备一个500毫升的米高梅股票：
1. 从500毫升的瓶子中取出100毫升的F-10培养基，并将去除的培养基储存在4℃，以进行任何潜在的使用
2. 将100ml过滤的FBS加入到400ml F-10培养基中。加入5ml Pen/Strep溶液
3. 将介质储存在4°C
4. 使用前，请在37°C温热所需的量
5. 在使用细胞培养基之前加入10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）（注12）
6. 每道菜需要10毫升米高梅
后隔离洗涤介质
50 ml：
补充49.5毫升具有500微升Pen/Strep的F-10培养基，以达到1％Pen/Strep浓度
这可以在4°C储存。使用前温度37°C
分化培养基（DM）
对于500毫升的库存：
1. 从500毫升的瓶子中取出15毫升的DMEM（ATCC）
2. 将10 ml过滤的马血清加入到DMEM瓶中
3. 向上述混合物中加入5ml Pen/Strep，以达到1％Pen/Strep
  的浓度
4. 将该库存存放在4°C
5. 使用前温度要求在37°C以上
冷冻介质
10 ml：
将5 ml MGM（参见食谱8）与4 ml过滤的FBS（40％FBS）和1 ml DMSO（10％）结合使用
这可以在4°C下储存，并在使用前加热
4％多聚甲醛（PFA）
10 ml：

将0.4g PFA悬浮于10ml PBS中
以250rpm在60℃下摇动1-2小时直至完全溶解
允许在室温下冷却，并通过0.45μm注射器过滤器过滤
储存于4°C
为了获得最佳效果，如果存储超过2天
，请勿使用4％的PFA

0.3％Triton X-100

通过将1ml 100％Triton X-100与9ml PBS组合来制备10％Triton X-100的储备。
为了制备10ml 0.3％Triton X-100，加入300μl10％Triton X-100至9.7ml PBS

阻塞解决方案
对于50ml：

将1g BSA溶于50ml PBS中
使用0.45μm注射器过滤器过滤器
这可以保存在-20°C以备将来使用

DAPI
10 ml：
加入2μlDAPI储备溶液至10ml PBS，并使用0.45μm注射器过滤器过滤 DAPI的工作溶液可以在黑暗中保存在4°C

致谢

这项工作得到NIH拨款AR059810，AR068313和AG029623（对A. Kumar）和AR069985（到S. M.印地语）的资助。该协议已经从以前发表的文章中被修改和略微修改（Rando和Blau，1994; Hindi 等人，2014; Ogura等人，2015;印地语和Kumar ，2016）。

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