材料和试剂

由实验者选择的不同的气味对，以表示"Go"或S +刺激和"No-Go"或S-刺激。实施例：将1-丁醇和丙酸（分别为Sigma-Aldrich，目录号：437603和402907）稀释至10％的矿物油（Alfa Aesar，目录号：31911）（500μl矿物油中的气味剂）
带绿色聚丙烯孔盖的Qorpak硼硅酸盐玻璃小瓶（Qorpak，目录号：GLC-01016）
Nalgene硅胶管（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：8600-0030）
BD PrecisionGlide ^{TM 18号斜角针（BD，目录号：305196）}
成年小鼠（> 6周龄，我们的实验室平均使用12至19周龄的小鼠，平均体重为19g，女性为23g）

设备

超宽模块化测试室鼠标（Med Associates，目录号：ENV-307W）
不锈钢网格地板（Med Associates，目录号：ENV-307W-GFW）
针对宽鼠模块室的照明鼻响应（Med Associates，目录号：ENV-313W）（x2）
双通道嗅觉刺激（Med Associates，目录号：ENV-275）
照亮鼻子嗅觉响应与嗅觉口小鼠（Med Associates，目录号：ENV-375W-NPP）
独立USB接口，4输入/8输出仅与32位操作系统兼容（Med Associates，目录号：DIG-703A-USB）
带有Windows 2000，XP，Vista或7操作系统的标准台式电脑
VWR流量计，压克力（VWR，目录号：97004-952）

图2. Go/No-Go设备行为系统包含6个关键组件：行为室，水库，空气调节，USB接口系统，气味传递模块和个性化计算机（A）。室内空气首先从空气调节器传送到输入空气歧管，随后分配到两个含气味的玻璃小瓶和中心阀（B）。气味输出由两个螺线管（C）控制，可由Schedule Manager软件编程。气味进气管线，真空管路和两个分配器连接到行为室（D）。每个气味瓶与其自己的两个硅胶管配对，配有18号针头，以防止气味（E）的污染。

软件

MED-PC IV行为软件套件（Med Associates，SOF-735）
注意：此版本的软件现已被Med-PC V取代。
所有MED-PC用户（Med Associates，SOF-731）的MPC2XL数据传输实用程序，用于将数据重新格式化为Excel
计划管理软件（Med Associates，目录号：DIG-703A-USB），是编程培训阶段所需的

程序

建立行为室和程序化的嗅觉提示和奖励交付
1. 获取并设置小鼠的操作性调理行为室
  1. 设置必须包括模块化的气味和输水口。
  2. 关联学习的编程培训阶段需要能够运行Med-PC IV软件的计算机。
  3. Med-PC IV软件使用专有的编程语言，实验者必须学习编程培训阶段。每个培训阶段的具体要求包括：
    1. 对于所有阶段：每个块的试验被阻止到20个试验以计算每个鼠标的每个块的性能。
    2. 第一阶段：程序必须指定当其鼻子捅入中心输水口时，鼠标会收到水报酬。此阶段的输出参数为：试用期限和收到的奖励数量。
    3. 阶段2：程序必须指定鼠标只有在将其鼻子插入气味递送口（中心端口）后才从两个侧面端口接收到水奖励。即使鼠标没有到达侧面端口进行奖励，中心戳之后应立即分配水。输出参数：试用期，试验次数和及时报酬次数（在中心港口的5秒钟内收到）。
    4. 第3阶段：程序必须指定向中心港口发送Go（S +）气味。只有在5秒钟的时间内，如果鼠标鼻子在侧端口发出气味，才应该分配水分。该程序还必须在中心端口鼻尖产生奖励所需的时间长度内以50毫秒逐步增加（从100-400毫秒）自动形成小鼠的行为。如果在20次试验的一个块内，鼠标在80％的时间内足够长的时间在中心端口上戳，程序应该将所需时间增加50毫秒。输出参数与第2阶段相同，加上收到的奖励数量和所有试验中正确答案百分比。
    5. 第3阶段：伪训练：该程序用于经过训练的小组对照组，而不考虑Go或No-Go（S-）气味的奖励或惩罚。所有参数与正常阶段3相同，除了不会引入S +气味。
    6. 第4A阶段：在这个阶段，程序必须从所有的试验开始，提供Go/S +加味剂，如阶段3.当小鼠完成1-2块Go/S +试验时， 85％的准确性，实验者可以对半数试验的S-/Go气味进行随机分配。如果鼠标不准确地在No-Go提示后寻求水奖励，则会给予2秒的超时罚款。为了帮助小鼠区分Go和No-Go试验，实验者可以在Go试验期间对端口附近的舱室进行编程，并在No-Go试验期间关闭。输出参数包括：试用时间，试验次数（中心口鼻孔数），完成试验次数（中心口鼻孔数超过400毫秒），正确响应数，接收到的奖励数。
    7. 第4B阶段：程序必须将老鼠的"超时"惩罚增加到4秒。输出参数与阶段4A相同。
    8. 第4阶段：伪训练：与第4B阶段相同，除了奖励和惩罚被随机分配给Go/S +和No-Go/S-气味。
    9. Go/No-Go：这个阶段代表"测试"阶段，并且可以在一对新颖的气味剂上进行，以测试如何精确地对实验对照小鼠进行气味关联。输出参数与阶段4A相同。如果在舞台4A中编程了侧灯，程序现在应该消除这些侧灯提示
关联学习（Go/No-Go）任务
1. 小鼠的制备[3天]
  1. 在初步训练前3天，水被限制为40毫升/公斤/天，小鼠习惯于测试环境和室。
    1. 可以进行对对照动物的水限制的初步试验，以确定为维持行为任务的表现而提供的最小水量，而不超过人为的终点（National Research Council 2003），由实验者的IACUC指导确定。在我们手中，每只鼠每天40毫升/公斤足以维持性能，同时避免超过每只动物基线15％的体重减轻。这个终点是由于啮齿动物能够补偿逐渐的水分限制范例，并且能够承受高达基线体重的15％的损失，而不会显示遇险指标（Rowland，2007）
    2. 在限水期间，小鼠每天必须称重，以确保其高于基线质量的85％。如果小鼠低于该阈值，则从研究中移除，并提供自由水
    3. 请注意，与其他行为范例一样，结果可能会随着程序的细微变化而精细变化。因此，在培训开始之前，确保所有环境因素（温度，噪音，杂散气味）在整个协议中保持不变，实验观察者不会引入随机变异（例如，香水或观察员/处理程序的不规则变化）。
2. 初步培训[8-24天]
  1. 小鼠分为控制组，伪训练组或训练组。
    1. 对照小鼠不再接受治疗。
    2. 伪训练小鼠的治疗方式与训练有素的组相同，除了每个试验均以相同的概率产生奖励和惩罚，无论所呈现的气味如何。
    3. 受过训练的小鼠进行Go/No-Go嗅觉关联学习范例。
  2. 配置行为室，只有一个中央端口可用于提供水。（图3A）
    
    图3.行为室中的端口配置。阶段1包含中央水端口（A），侧面端口不可访问。所有其他阶段（包括Go/No-Go测试阶段）均采用中心气味口和两个水侧端口（B）进行。
  3. 对受过训练的训练有素的老鼠进行初步训练的以下阶段
    1. 阶段1 [1-3天，60分钟/小鼠/天]：小鼠学会将房间与水的存在联系起来。
      1）让每只老鼠探索房间，发现港口输送水。
      2）完成标准：60分钟内100次试验。
      注意：
      1）水阀的声音可能会使老鼠感到震惊，可能会停止演奏。如果老鼠太害怕探索，可以提供"自由"的水。这是通过使用软件上的定时输出选项来完成的，可以向输水口输送约200毫秒的水。
      2）如果尽管自由送水，如果鼠标冻结或停止探测，请让鼠标停留在腔室中，直到60分钟结束。删除并重复这个阶段在第二天的那只老鼠。
      3）在试验之间清空小鼠的固体废物。用70％乙醇喷洒并擦拭小室，以防止气味分散。
      4）即使在群体内，小鼠表现出自然的变异性。因此，当平均性能在上述标准的合理范围内（60分钟内完成100次试验）时，可以将小鼠作为一组升级为第2阶段。
    2. 阶段2 [1-5天，60分钟/小鼠/天]：小鼠被教导鼻捅入中心端口以获得从双方端口分配的自动水回报。
      1）配置室具有一个中心端口进行气味输送和两个侧面端口供水（图3B）。这将是实验剩余部分的房间。
      2）完成标准：40-50 + 60分钟试用，至少25-50％及时奖励。及时的奖励是在中心港口的鼻尖戳5秒内收到的。
    3. 阶段3 [1-3天，60分钟/小鼠/天]：小鼠必须先在5秒钟内进入中心端口，然后侧端口才能获得奖励。此外，在向任何一个侧面端口寻找水以获得分配的奖励之前，小鼠必须在中心突出更长时间（长达400毫秒）。这个阶段还介绍了Go/S +气味与水奖励配对。
      1）完成标准：> 60分钟内获得60奖励。
      2）对伪训练对照组应用3级伪训练，但不要引入S +/Go气味。
    4. 阶段4A [1-2天，60分钟/小鼠/天]：该阶段在Go vs. No-Go任务上训练小鼠，并介绍No-Go/S-气味，以及2秒的时间处罚小鼠在No-Go提示上寻求水奖励。该程序将从所有Go/S +气味演示开始。鼠标在所有Go/S +试验的1-2个块上表现良好后，参数可以切换到50％的Go/S +和50％的No-Go/S-试验。
      1）完成标准：40次试验与> 60％正确答案。
      2）对伪训练对照组应用4级伪训练
    5. 第4B阶段[5-11天，60分钟/小鼠/天]：这个阶段，在No-Go/S-试验中不正确地寻求奖励的老鼠处罚时间增加到4秒，或者没有在Go/S +审判。
      1）完成标准：> 60分钟内100次试验> 85％的准确度。
      注意：
      1）保持日常跟踪不仅每个会话的总百分比正确，而且每个会话的最大％和最小百分比是正确的，以监视每个鼠标在这个阶段的进度。
      2）在我们手中，85-90％的对照小鼠达到完成标准。如果研究要求小鼠继续进入Go/No Go测试阶段，我们建议排除不符合这些标准的老鼠，因为他们没有表现出足够的执行任务能力。 > 3）实验者可能希望在本阶段结束时对"反转"训练进行编程，其中Go和No-Go气味被置换在气味瓶平台上的位置。这是为了确保小鼠不会提示另一个刺激（例如， ，与一个或另一个端口相关联的特定阀的声音）。
3. Go/No-Go试用[1天，〜20分钟/小鼠/天]
  1. 现在已经充分了解了训练阶段4B的小鼠已经充分了解了行为任务，并且可以暴露在新的气味对中，以测试他们区分新气味（例如，立体异构体如+和 - 柠檬烯）的能力。。
  2. Go/No-Go试验的参数与第4B阶段的参数相同，除了中心端口300毫秒的鼻孔足以使老鼠执行Go或No-Go动作。
  3. 在程序中输入实验细节。将每只鼠标放入室内，并从屏幕界面中选择正确的程序运行。
  4. 统计分析的终点或变量由实验者确定，但在我们手中，控制小鼠通常会在大约200-400次试验或10-20次阻断之后显示新的气味对（> 85％正确反应）的准确性能。 br />

数据分析

在训练有素的组中，只有执行Go/No-Go试验的小鼠在>在我们的电路测绘实验中使用了85％的精度（Huang等人，2016）。不符合标准的小鼠不包括在进一步的研究中。此外，可以针对训练中使用的初始两种相关气味（图4A）以及任何后续重新相关联的气味（图4B）显示嗅觉学习进展。任何统计软件包都可用于分析数据，具体测试取决于实验者的需求。在Huang等人的中。（2016），通过双因素方差分析比较了训练有素的，假性的和对照组中嗅球的连通性模式。

图4.学习曲线在第4B阶段，小鼠随机出现Go和No-Go试验。一组5只小鼠（A）显示了连续试验块的平均百分比正确选择（20次试验/阻断）。错误栏显示一组内所有动物的相同块的标准错误。一旦小鼠成功训练，重新结合新的气味剂也可以类似地绘制（B）。

笔记

为了减少实验之间的差异性，我们建议在所有测试组之间分配实验动物年龄和性别的对照组合。
确保行为室上的所有管道和配件都牢固地连接到其底部，以防止气味泄漏。
在低交通，昏暗的地方设置行为箱，以防止对小鼠的注意力。
保持室内空气流量为〜3-5L/min，并调节中心端口的真空吸力，以避免试验之间的气味。
使用气味专用管将气味小瓶连接到行为室。这样可以消除气味剂的交叉污染。
在笼子/套小鼠之间用70％EtOH彻底清洁盒子。

食谱

气味准备

在硼硅酸盐玻璃小瓶中加入500微升的气味和4.5毫升矿物油
准备两个1英尺长的硅管，并将其一端装入分开的18号针头。两针都将放入气味瓶中（补充视频2 ），管端将安装在进气口或出气口的气味盒上
总是在同一天准备新的气味。气味每周都会重塑

致谢

该协议是从我们实验室以前的工作（Huang等人，2016）中改编而成。它得到McNair医学研究所的支持，NINDS授予R01NS078294给B.R.A.和NIH IDDRC授予U54HD083092。作者声明没有利益冲突，没有竞争的利益。

参考

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Huang，L.，Ung，K.，Garcia，I.，Quast，KB，Cordiner，K.，Saggau，P.and Arenkiel，BR（2016）。< a class ="ke-insertfile"href = http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27559168"target ="_ blank">任务学习促进嗅球中的中间神经连通性图的可塑性。 Neurosci 36（34）：8856-8871。