材料和试剂

10厘米组织培养皿
1.5 ml微量离心管
PCR管
15和50ml聚丙烯管
Q-PCR板
细胞
具有3'BIOTIN操纵的miRNA序列的定制合成
磷酸盐缓冲盐水（PBS）
蛋白酶抑制剂（100x混合物）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：78430）}
RNAse抑制剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：EO0381）
链霉亲和素 - Dyna珠（Dyna珠M-280链霉抗生物素蛋白）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：11205D）}
酵母tRNA（原料10 mg / ml）（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^{TM，目录号：AM7119）}
TRIzol（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：10296028）
氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：C2432）
2-丙醇（Sigma-Aldrich，目录号：I9516）
GlycoBlue ^{TM共沉淀物（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM9515）}}
200％防霉乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：E7023）
无核酸酶水（质量生物，目录号：351-029-721）
逆转录系统（Promega，目录号：A3500）
Micro RNA RT Kit（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystem ^TM）
miRNeasy Mini Kit（QIAGEN，目录号：217004）
Qiashredder（QIAGEN，目录号：79656）
RNAiMax（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：13778150）}
氯化钾（KCl）
氯化镁（MgCl 2）
三盐酸盐（pH 7.5）
IGEPAL CA-630（Sigma-Aldrich，目录号：I8896）
氢氧化钠（NaOH）
氯化钠（NaCl）
裂解缓冲液（见配方）
解决方案A（见配方）
解决方案B（见配方）

设备

磁分离架Magnesphere ^®技术（Promega，目录号：Z5342）
迷你管旋转器（Fisher Scientific，型号：Fisher Scientific ^TM迷你管旋转器，目录号：05-450-127）
冷冻微型离心器^TM micro 21R（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall TM Legend ^TM 21R）
ABI步骤1加上Q-PCR系统（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystem TM，，型号：StepOnePlus ^{TM实时PCR系统，目录号：4376599）}
Veriti 96孔热循环仪0.2毫升合金（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystem），型号：Veriti 96-Well Thermal Cycler，目录号：4375786）
-20°C冷冻机
Vortexer

程序

在3'末端用生物素标记的感兴趣的miRNA和加扰对照miRNA从Dharmacon商业合成（Phatak等人，2016）。在10厘米组织培养皿中重复转染前一天种细胞。细胞应以密度接种，使其不>收集时80％汇合。二十四小时后，用对照miRNA和3'生物素标记的miRNA以10-100nM的终浓度转染细胞。 RNAimax用作转染试剂。根据制造商的指导方针进行转染。转染后48小时，收获全细胞裂解物。（时间和浓度需要优化，因为它随细胞系和miRNA而变化）。培养基可能在转染后一天更换。

细胞裂解物制备
1. 从培养皿中取出培养基，用冰冷的1x PBS仔细洗涤细胞两次。在4℃下将细胞刮除或胰蛋白酶消化，以2,000×g旋转5分钟。收集颗粒前先冷冻微量离心管。
  注意：此时可将颗粒保存在-80°C。
2. 如果继续裂解物，则加入补充有蛋白酶抑制剂（PI）和RNase抑制剂的550μl裂解缓冲液。（在裂解时始终添加PI和RNase抑制剂）。通过上下移动几次将细胞与裂解缓冲液混合。在冰上孵育10分钟。将细胞溶解产物在4℃，18,000×g离心10分钟。将上清液收集到新的微量离心管中。
3. 同时制备链霉亲和素 - Dyna珠（每个样品50μl）。
4. 用500μl溶液A洗涤珠子两次
5. 用500μl溶液B洗涤珠子两次。
6. 用1ml裂解缓冲液洗涤珠珠三次。在每次洗涤过程中，将管置于磁性支架上，小心取出上清液，不要将珠子取出。
7. 使用500μl裂解缓冲液和10μl酵母tRNA在4℃的旋转器上孵育2小时。
下拉
1. 孵育2小时后，将含有珠粒的管放在磁性支架上，取出上清液，用1 ml裂解缓冲液清洗珠子一次。
2. 将500μl裂解物与珠混合，并在4℃下在旋转器上孵育过夜。保存在-80°C左右的50μl裂解液，将用作输入。
3. 第二天，将管短暂离心，放在磁性支架上，取出上清液。用1 ml裂解缓冲液洗涤珠子4次。
RNA分离
1. 将保存的裂解物从-80°C取出，在冰上解冻。
2. 每个样品加入750μlTrizol LS和250μl水至输入和下拉珠，并充分混匀。将管保存在-20°C冷冻箱至少2 h。这是额外的停车点。管可以保持在-20℃过夜。
3. 在室温下解冻混合物，加入200μl氯仿，旋转45秒，并在室温下保持2-3分钟。
4. 在4℃18,000 x g离心15分钟。
  注意：提前打开离心机，这样当管子准备好旋转时，它已经在4°C。
5. 将上层转移到新管（约500-600μl）。丢弃旧管。
6. 加入等体积的2-丙醇和5μl糖蛋白，通过倒转管数次混合。在室温下孵育10分钟。
7. 在4℃18,000 x g离心15分钟。丢弃上清液非常小心。用1ml预冷却的70％乙醇洗涤沉淀两次。
8. 小心地清洗上清液。空气干燥沉淀，并将其重悬于20μl无核酸酶的水中
RT-PCR
1. 使用生物素标记样品的全部20μlRNA和来自输入样品的1μgRNA进行mRNA RT反应。根据制造商的说明设置mRNA RT反应。
2. 使用具有特定miRNA引物的TaqMan miRNA反转录试剂盒，每15μl反应使用10 ng总RNA进样量。这是测量miRNA水平所必需的
3. 用mRNA-RT试剂盒对cDNA进行三次重复PCR， cDNA的体积将需要优化，因为靶标的结合能力会有所不同。如果可能，请包括阳性对照（特定miRNA的已知靶标）。 GAPDH可用作加载控制。
4. 对于微RNA水平，使用一式三份的micro-RNA cDNA分开进行q-PCR。小核RNA U6可用于加载控制。

数据分析

计算miRNA富集如下：
用于CUGBP1 mRNA的双miR-214-3p下拉菜单/用于CUGBP1mRNA = X的扰码控制下拉 Bi-miR-214-3p输入/扰频控制输入= Y（在下拉段落中保存在步骤2中）
折叠装订= X / Y。
结果表示为来自三个独立实验的平均值±SD，每组实验具有最小三次重复（Phatak等人，2016）。将来自多个测定的数据进行双尾Student's测试和 P 0.05被认为具有统计学意义。

食谱

裂解缓冲液
20mM Tris-HCl（pH7.5）
100 mM KCl
5mM MgCl 2
0.3％IGEPAL CA-630
解决方案A
0.1 M NaOH
0.05 M NaCl
解决方案B
0.1 M NaCl
70％乙醇
用200克100％乙醇稀释无核酸酶水，使用前先冷冻

致谢

这项工作得到了退伍军人事务部职业发展奖（J.M.D.）和马里兰大学医学院外科系（J.M.D.）的部门资金支持。
利益冲突：无。
如前所述修改和修改了该协议（Orom和Lund，2007; Choi等人，2014）

参考

Choi，YE，Pan，Y.，Park，E.，Konstantinopoulos，P.，De，S.，D'Andrea，A.and Chowdhury，D。（2014）。＆lt; a class ="ke-insertfile" href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24843000"target ="_ blank"> MicroRNAs下游循环细胞G1期的同源重组，以维持基因组的稳定性。 em> Elife 3：e02445。
Orom，UA and Lund，AH（2007）。＆nbsp; 隔离的微小RNA靶标使用生物素化的合成微小RNA。 43（2）：162-165.3。
Phatak，P.，Byrnes，KA，Mansour，D.，Liu，L.，Cao，S.，Li，R.，Rao，JN，Turner，DJ，Wang，JY和Donahue，JM（2016） miR-214-3p在食管鳞状细胞癌细胞中的过表达增强敏感性通过直接和间接通过CUG-BP1靶向存活素来顺铂。致癌基因 35（16）：2087-2097。