材料和试剂

玻璃试管（约10 x 90 mm）
电子。大肠杆菌在通气下生长的MWC215（Sm ^R ndh :: Cm ^R）或GR70N（野生型或突变型）细胞
Luria肉汤或适用于E的有氧生长的其他培养基。大肠杆菌文化
抗生素，特别是E。大肠杆菌菌株
溶菌酶
乙二胺四乙酸（EDTA）
硫酸镁（MgSO 4）
二硫苏糖醇（DTT）
苯甲磺酰氟（PMSF）
乙醇
液体N 2
电势敏感探针Oxonol VI（Sigma-Aldrich，目录号：75926）
硫酸铵（NH 4）2 SO 4
Decylubiquinone（Sigma-Aldrich，目录号：D7911）
氰化钾（KCN）
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸减少（NADH）
罗利尼他汀
泛醌1（Sigma-Aldrich，目录号：C7956）
三磷酸腺苷（ATP）
Aurovertin B（Sigma-Aldrich，目录号：A5297）
注意：本产品已停产。
Tris-HCl
蔗糖
HEPES
氢氧化钾（KOH）
氯化钾（KCl）
氯化镁（MgCl 2）
3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）
1,3-双（三（羟甲基）甲基氨基）丙烷（BTP）
介质（见配方）
缓冲液A（参见食谱）
缓冲液B（参见食谱）
缓冲区C（见配方）
缓冲区D（见配方）

设备

200毫升锥形瓶
2升三角烧瓶
振荡器，如Sertomat R/Sertomat HR或其他合适的
离心机，如（赛默飞世尔科技，型号：Sorvall RC 5C Plus）
转子（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：SS-34，SLA 3000; Beckman Coulter，型号：Ti70）}
超声波发生器（艾默生，型号：Branson Sonifier Cell Disruptor B15）或其他尖端直径10-12 mm
UV/VIS分光光度计（，Ocean Optics，型号：HR2000）

程序

细胞

将细胞接种到5-100毫升（取决于你第二天要生长多少）LB（+抗生素依赖于菌株）获得过夜培养（RT，轨道摇床）。
在50ml至200ml锥形瓶中的LB（用抗生素（如果需要））接种过夜培养物1:50，并在37℃，220-230rpm下在轨道摇床中生长〜4-5 h（野生型的A <600>〜2.5）。遵循增长：细胞必须在晚期指数期收获。不要过度生长，否则细胞壁会变厚，细胞分解就会有问题。
在SLA 3000或其他合适的转子中以7,000 xg（8,000rpm）×10分钟在SS-34或8,000rpm×20分钟内的颗粒细胞（约8,000xg时为10-20分钟） em>）。

浮游生物

将缓冲液A中的10ml（2×50ml培养物）或100ml（3×700ml培养物）的RT悬浮细胞沉淀（参见方案1）。
加入100μg/ml溶菌酶（10mg/ml储备溶液），并在室温下孵育，直到细胞变得渗透（不要长于需要处理细胞） 5-10分钟为此，进行渗透敏感性试验。将50μl细胞置于玻璃管中的1 ml 10 mM EDTA，pH 7.0中。观察到的裂解（悬浮液变得透明）应该在1-2分钟内发生。在这些条件下，没有溶菌酶的细胞不会被破坏注意：记住在溶菌酶添加之前要控制！没有溶菌酶的细胞保持完整，应与溶菌酶处理的细胞进行比较，通过匹配细胞悬浮液的浊度来进行比较。
加入4mM MgSO 4（来自1M储备溶液）和痕量DNA酶。悬浮液粘度几乎会立即下降。
在SS-34中以7,500×g（8,000rpm）×10分钟的颗粒状原生质球。
将冰原上的原生质球悬浮于20毫升或40毫升冷缓冲液B中（见方案2）。
加入2mM二硫苏糖醇（DTT）（来自100mM储备溶液），0.5mM PMSF（来自100mM新鲜储备液）。
注意：

PMSF在水溶液中使用寿命短。只有在无水乙醇保持厌氧的情况下才是稳定的，所以最好的方法是在95％的乙醇中制备新鲜的储液。
该培养基是任选的，可以依赖于进一步的实验而改变，然而，高的[Mg 2+]，二硫苏糖醇（DTT）和蛋白酶抑制剂PMSF总是显着改善膜质量。缓冲液B被开发用于通过质子泵测量囊内酸化。为了监测低盐浓度的电位产生缓冲液C（见下文）。

膜（冰/水浴）

超声处理的原生质球在约75 W（瓦特）。为了有效的超声处理，超声波发生器尖端和具有原生质球悬液的管壁之间的距离不应大于6-8mm。为了防止过热，使用50％超声波脉冲。大约超声处理30秒，冷却1分钟。对于渗透敏感细胞，应重复4-6次。细胞破坏可以被视觉控制。
在SS-34中以7,200×g×10分钟的颗粒未破裂的细胞和细胞碎片，并将其丢弃。
30,000 x g（40,000 rpm）x 40 min的Ti70中的颗粒膜或80,000-150,000 x g的其他合适的转子30-40分钟。如果需要较大内部体积的膜囊泡，则沉降应进行更短或较低的RCF（相对离心力）。
如果需要，冲洗沉淀物，并悬浮所需缓冲液B的膜（最小体积）（参见方法2）。
如果不使用膜，立即将其以等分试样冷冻在液体N 2中，并储存在-80℃。
通过使用ψ敏感探针Oxonol VI监测由质子泵产生的电位（ψΔψ），可以简单地测试获得的膜囊泡的质量，如图1。可以通过用施加的扩散电位进行吸收变化的校准来估计Δψ的值，例如，Gulli等人，1997; Pouliquin 等人，1999）。可以在质子解偶联剂如羰基氰化物间氯苯基肼（CCCP）或钾转运蛋白缬氨霉素存在下建立扩散电位。可以通过能斯特方程计算扩散电位的值。该程序的详细描述可以在Gulli等人，1997年的论文中找到。
膜结合复合物I的NADH：泛醌还原酶活性可以在缓冲液C中在30℃下通过在340nm处进行NADH氧化来测量（ε= 6.2mM ^{/SUP>）。由E，E制备的膜泡囊中的复合物I的NADH：泛醌氧化还原酶活性。大肠杆菌GR70N为0.92±0.13（n = 10）（Belevich等人，2011）。

图1.在E中的三个质子泵产生电势之后。使用Δψ敏感性探针Oxonol VI进行大肠杆菌膜。将膜泡囊装载缓冲液D.该培养基由用5mM（NH 3）（将ΔpH转换为Δψ）和Oxonol VI2.5μM（存储在2-5中） mM乙醇或甲醇储备溶液，-20℃，稳定至少一半）。以80μg/ml的浓度加入膜。反应之后是如所示的吸收变化的测量。通过NADH：泛素氧化还原酶I型（复合体I）监测Δψ}产物，用100μM十二氟酮和1mM KCN完成培养基以阻断末端氧化酶。加入50μMNADH以开始反应，由浓度1μM的复合物I抑制剂，罗替尼汀（Rollini）消散Δψ。通过喹诺酮氧化酶 3 监测Δψ，使用50μM泛醌1完成培养基。加入反应物2mM二硫苏糖醇，通过1mM KCN加入消散Δψ。为了通过ATPase监测产生Δψ，用1mM MgSO 4完成培养基。通过加入1mM ATP开始反应，通过加入浓度为10μM的ATP酶抑制剂，羟化蛋白B（Auro B）消耗Δψ。

笔记

该协议提供了高度可重复的结果，但是所有程序应尽可能快地进行。断裂（特别是在细胞破碎步骤之后）可能导致通过膜的质子泄漏增加，膜酶活性降低。
该协议特别为E开发。大肠杆菌细胞，不应该用于其他细菌物种而不进行修改。

食谱

缓冲区A
200mM Tris-HCl，pH8.0
2 mM EDTA
30％蔗糖
缓冲区B
100mM HEPES-KOH，pH7.5
100 mM KCl
10mM MgCl 2
缓冲区C
25mM HEPES-BTP，pH7.5
3 mM KCl
缓冲区D
100mM MOPS-BTP，pH 7.0
1mM MgSO 4

致谢

这项工作得到了Biocentrum赫尔辛基，Sigrid Juselius基金会和芬兰科学院的资助。

参考

Euro，L.，Belevich，G.，Verkhovsky，M.I.，Wikström，M.和Verkhovskaya。 M.（2008）。保留的膜的赖氨酸残基亚基NuoM通过质子泵浦的NADH：泛醌氧化还原酶（复合物I）参与能量转换。 Biochim Biophys Acta 1777（9）：1166-1172。
Belevich，G.，Knuuti，J.，Verkhovsky，MI，Wikström，M，Verkhovskaya，M。（2011）。通过定点突变检测大肠杆菌呼吸复合物I的亚单位L中的长α螺旋的机械作用。 Mol Microbiol 82（5）：1086-1095。
Ghelli A.，Benelli，B.和Esposti，MD（1997）。< a class ="ke-insertfile"href ="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=+的+膜+电位的测量+++由复杂+ I+中+ submitochondrial颗粒+生成+"。 target ="_ blank">测定由复合物I在遗传性粒子中产生的膜电位。生物化学121（4）：746-755。
Pouliquin，P.，Grouzis，J.和Gibrat，R。（1999）。< a class ="ke-insertfile"href ="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term通过与氧杂菁++ VI +++被动NO3-+传输+的电=+研究+++分离植物根+++血浆膜"。目标="_ blank">通过被分离的植物根膜进行被动NO 3转运的oxonol VI的电生理研究。 Biophys J > 76：360-373。