材料和试剂

提取人源供体的单核细胞Buffy Coats
1. 50ml Falcon管（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
2. T175培养瓶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：178883）}
3. 无菌巴斯德移液器（BIOLOGIX GROUP LTD技术，目录号：30-0138A1）
4. 封面
5. 组织培养包被的6孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：140675）}
6. Buffy外套是从北爱尔兰输血服务（NIBTS）获得的，遵循贝尔法斯特女王大学学校研究伦理委员会的伦理批准
7. Hank's缓冲盐溶液（HBSS）No Ca ^{2 +}或Mg ^{2 +}（Thermo Fisher Scientific，目录号：14170138）
8. Ficoll-Paque（GE Healthcare，目录号：17-5442-03）
9. 完成RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：21875034）
10. 胎牛血清（FCS）（热灭活）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10270106）}
11. 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）（PeproTech，目录号：300-03）
12. 青霉素/链霉素10,000U/ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
13. 台an蓝（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15250061）
14. 完成1％FBS RPMI（见配方）
15. 完整的RPM子IGM-CSF （见配方）
人骨髓间充质干细胞培养（MSC）
1. 50ml Falcon管（SARSTEDT，目录号：62.554.502）
2. 8孔室玻片（Sigma-Aldrich，目录号：C7182）
3. 组织培养包被的6孔和24孔板（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：140675,142475）}
4. Pechiney PM999 Parafilm（Bemis，目录号：PM999）
5. 显微镜幻灯片
6. 无菌Eppendorf管（SARSTEDT，目录号：72.690.001）
7. 流量管（SARSTEDT，目录号：55.475）
8. 人骨髓来源的MSC从得克萨斯A& M健康科学中心医学院的再生医学研究所（德克萨斯州Temple）的NIH储存库获得。细胞符合国际细胞治疗学会（Dominici等人，2006）定义的MSCs分类的所有标准。
9. 液氮
10. Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14190094）}
11. 完整的α-MEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：22561021）}
12. 青霉素/链霉素10,000U/ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
13. L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25030024）}
14. 细胞松弛素B（Sigma-Aldrich，目录号：C6762）
15. 10x胰蛋白酶（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15250061）
16. 胎牛血清（FCS）（热灭活）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10270106）}
17. 台盼蓝（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：15250061）
18. MitoTracker深红色FM探针（APC）（Thermo Fisher Scientific，Molecular Probes ^{TM，目录号：M22426）}
19. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma-Aldrich，目录号：D8418）
20. 完成α-MEM（参见食谱）
21. 线粒体染色溶液（1％FBSα-MEM 1％MITO ）（参见食谱）
22. 细胞松弛素B溶液（1％FBSα-MEM <1％CYTO ）（参见食谱）
共焦显微镜
1. 0.45μm滤膜（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
2. Pechiney PM999 Parafilm（Bemis，目录号：PM999）
3. 纸巾
4. 显微镜幻灯片
5. 盖子
6. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10010023）}
7. 多聚甲醛（PFA）（Sigma-Aldrich，目录号：158127）
8. 1N NaOH（Sigma-Aldrich，目录号：S2770）
9. 1N HCl（Sigma-Aldrich，目录号：H9892）
10. 正常山羊血清（NGS）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：31872）
11. 小鼠抗人CD45一抗（Abcam，目录号：ab8216）
12. 小鼠IgG1同种型（Abcam，目录号：ab81032）
13. 山羊抗兔子Alexafluor 405二抗（Abcam，目录号：ab175655）
14. Brightmount/Plus水性安装介质（Abcam，目录号：ab103748）
15. 指甲油
16. 1％FBS PBS（参见食谱）
17. 4％多聚甲醛（PFA）（见配方）
18. 强和弱块免疫荧光染色（见配方）
流式细胞仪
1. 细胞刮刀（Fisher Scientific，目录号：08-100-241）
2. Sarstedt 5毫升聚苯乙烯圆底流量管（SARSTEDT，目录号：55.1578）
3. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10010023）}
4. 人FcR结合抑制剂（Thermo Fisher Scientific，eBioscience ^{TM，目录号：14-9161-73）}
5. 抗人CD45（PE）抗体（Thermo Fisher Scientific，eBioscience ^{TM，目录号：12-9459-41）}
6. 同种型对照（IgG1 kappa）（Thermo Fisher Scientific，eBioscience ^{TM，目录号：12-4714）}
7. Zombie Aqua Fixable Dye（BioLegend，目录号：423101）
细菌培养和吞噬分析
1. 大肠杆菌K1型菌株
2. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10010023）}
3. LB肉汤（Lennox）（Sigma-Aldrich，目录号：L3022）
4. LB琼脂培养液（Lennox）（Sigma-Aldrich，目录号：L2897）
5. Hank's缓冲盐溶液（HBSS）No Ca ^{2 +}或Mg ^{2 +}（Thermo Fisher Scientific，目录号：14170138）
6. 完成RPMI 1640（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：21875034）
7. 皂苷（Sigma-Aldrich，目录号：47036）
8. 庆大霉素（Sigma-Aldrich，目录号：G1397）
9. 完成1％FBS RPMI（见配方）
10. 0.5％皂角苷（参见食谱）

设备

水浴（37°C）（Grant仪器，型号：JBN12）
离心机（Eppendorf，型号：5810 R）
层流柜（包含空气解决方案，型号：BioMAT 2安全柜2类）
血细胞计数器和盖玻片（Hawksley Medical and Laboratory Equipment，型号：AC1000 Improved Neubauer，catalog number：BS 748）
孵化器（Panasonic Biomedical，型号：MCO-170AIC-PE）
Dmi1显微镜（Leica Microsystems，型号：DMi1）
TCS SP5 II Leica共聚焦显微镜（Leica Microsystems，型号：TCS SP5 II）
BD FACSCanto II流式细胞仪（BD，型号：BD FACSCanto II）
涡旋（Cole-Palmer仪器，目录号：UY-86579-20）
2-20微升移液管（Gilson，目录号：F123600）
20-200μl移液器（Gilson，目录号：F144565）
100-1,000μl移液器（Gilson，目录号：F144566）
Midi Plus ^TM移液管控制器自动（Sartorius，目录号：710931）

软件

FlowJo软件（FlowJo）
Prism 5软件（GraphPad软件）
LAS-AF软件（Leica共焦显微镜）
FACS DIVA软件（流式细胞仪）

程序

从供体Buffy Coats中提取单核细胞

单一供体白细胞血沉棕黄层是从贝尔法斯特血液输血中心（NIBTS）获得的，或者遵循伦理批准（大约50毫升/血袋/志愿者）的志愿者。
在分离前1-2小时将所有培养基（HBSS，1％FBS RPMI和10％FBS RPMI）预热至1-2小时，然后分离前将离心机预温至20℃。
在层流柜下，将供体血液倒入T75烧瓶中，并使用无菌HBSS稀释（1:2），并通过倒置混合。
将15 ml Ficoll-Paque吸入4 x 50ml的猎鹰。
将稀释的血液以45度角轻轻地分层到Ficoll上，注意不要混合各层。用HBSS补充剩余的管，使最终体积达到50ml。
将所有管以480 x g，20℃离心20分钟而不用制动。
旋转后，将珠光白色层（血沉棕黄层，如图1所示淋巴细胞，单核细胞和血小板层）定位，通过等离子体密度梯度界面沉淀。使用巴斯德吸管将其提取成新的无菌50ml隼

图1.用于说明从外周血中分离单核细胞的示意图将血液分层到Ficoll上，如上所述离心分离而不用制动器，将血液成分分成多层。巴斯德吸管用于小心地去除下游加工中使用的淋巴细胞，单核细胞和血小板层。
为了洗涤细胞，将40ml HBSS加入到单核细胞中，并通过倒置混合
再次以290 x g，4℃离心5分钟制动。缓慢吸出上清液（注意颗粒可能变松，再加入40 ml HBSS）。重复此洗涤步骤3次。
最后一次洗涤后，将沉淀重悬在10ml完整的1％FBS RPMI中，并通过涡旋或倒置充分混合。
在血细胞计数器上放置盖子，并通过毛细作用将10μl细胞混合物装入装载通道。
在37℃，5％CO 2培养箱中孵育至少5分钟（见注1）。
此后，在20倍放大倍率的显微镜下观察细胞。计数所有单核细胞（见注1）。

然后使用3ml完全1％FBS RPMI（参见表1其他种子密度），将细胞以6孔板的1×10 6个细胞/孔的密度接种。在37℃，5％CO 2孵育至少2小时以确保单核细胞已经粘附到该孔的塑料上。

表1. MSC和MDM（1:20比率）播种密度

否。的MSC /井	否。的 MDM /井	牌类型	最终音量（ml）的1％FBS RPMI<	实验分析技术
5 x 10 ⁴	1 x 10 ⁶	6井	3	流式细胞仪/Western
1.5 x 10 ⁴	3 x 10 ⁵	24井	1	ELISA/bioplex /吞噬分析
2.5 x 10 ³	5 x 10 ⁴	8孔室幻灯片	0.2	共焦显微镜

此后，用HBSS洗涤非贴壁细胞（淋巴细胞）两次（通过加入1ml HBSS，轻微搅动，然后抽吸废物）。
为了促进单核细胞衍生的巨噬细胞（MDM）成熟，用3ml完整的RPM IGM-CSF 替换完整的1％FBS RPMI（参见食谱）。
使细胞在37℃，5％CO 2下静置5-7天。
5-7天后，用HBSS洗涤细胞两次，并用3ml完整的1％FBS RPMI代替。在进行刺激实验之前让细胞休息1小时。

人类间充质基质细胞培养
1. MSC扩展和存储
2. 准备P3 MSC进行实验用途
  一旦准备好使用，在水浴（37°C）中除冰1×3 3的MSC冷冻机，并将全部1ml置于15-20ml的完全16％FBSα-MEM中，确保每隔一天进食。细胞保持培养直至P5-P6。
人间质基质细胞（MSC和单核细胞衍生的巨噬细胞（MDM））的直接共培养
1. 预热DPBS，HBSS，在37℃的水浴中，在开始前至少半小时，完成10％FBS RPMI，1％FBS RPMI，16.5％FBSα-MEM和1％FBSα-MEM实验。
  以下工作必须在机柜灯关闭的生物安全柜内完成。
2. 在70-80％汇合时，为了预先染色MSC线粒体，从T175烧瓶中吸出较老的16％FBSα-MEM，并加入20ml染色溶液（1％FBSα-MEM MITO 食谱和注2]），37℃，5％CO 2孵育约30分钟。
3. 对于MSC用细胞松弛素B进行预处理，至少在染色溶液（1％FBSα-MEM 子> MITO ）。由于Cyto B可溶于DMSO，因此请确保有一个控制瓶的细胞用于DMSO载体对照
4. 从烧瓶中吸取1％FBSα-MEM CYTO ，并用1％FBSα-MEM MITO替代，并在37℃，5％CO 2下孵育30分钟， sub> 2 。
5. 此后，染色溶液从MSC吸出，细胞在5ml DPBS中洗涤至少三次。
6. 吸入DPBS并加入7ml 1x胰蛋白酶（DPBS中稀释），并在培养箱中放置约2-5分钟。
7. 一旦细胞被适当地分离，加入7ml完整的α-MEM以抵抗胰蛋白酶作用并将细胞移液到50ml的猎鹰中。
8. 将细胞离心离心分离5分钟。
9. 在此期间，通过吸取较老的培养基并用1-2ml HBSS洗涤两次来制备MDM。
10. 吸出剩余的HBSS，并将MDM在培养箱中放置200μl（室载玻片），1 ml（24孔板）或3 ml（6孔板）1％FBS RPMI。
11. MSC离心后，吸出上清液，并将沉淀重悬于1 ml 1％FBS RPMI（见注3）。
12. 使用血细胞计数器计数细胞，使用台盼蓝排除，取决于实验所需的孔尺寸，种子相应的细胞密度和与MDM共培养24小时（见表1）。
13. 进行共焦显微镜或流式细胞术程序。
共焦显微镜染色程序
1. 在室载玻片上共培养后，小心地吸出培养基，并使用200μl冰冷的PBS洗涤细胞两次。
2. 吸出PBS并用100μl的4％PFA溶液固定细胞。
3. 在室温下温和搅拌约15分钟。
4. 再次用PBS洗涤两次后，继续用100μl强阻断细胞至少1小时。
5. 用PBS洗涤两次，并在弱块中加入50μl一抗抗体小鼠抗人CD45一抗或同种型对照小鼠IgG1（稀释1:200）。用Parafilm密封载玻片，并在4℃下孵育载玻片，搅拌过夜。
6. 第二天重复PBS清洗步骤，然后再加入50μl二抗山羊抗兔亚硝酸405二抗（在弱块中稀释1：1,000）1小时。在室温黑暗中孵育一小时。
7. 紧接着，重复PBS洗涤步骤，注意不要将载玻片暴露在光照下超过10分钟。
8. 轻轻地将腔室滑块轻轻敲打到纸巾上，以除去任何多余的PBS清洗液，然后小心地取出塑料腔室部分以分离下面的显微镜载玻片。
9. 加入约2-3滴安装介质，并将盖玻片放在染色细胞的区域上，确保除去所有气泡。允许在黑暗中风干30-45分钟。
10. 当干燥时，使用边缘周围的商业指甲油作为胶水并将盖玻片固定到位。
11. 使指甲油在室温下在黑暗中干燥。幻灯片还可以在黑暗中用Parafilm长时间密封保存在4°C，以备将来分析。
12. 使用共聚焦显微镜进行观察（图2）
  
  Fi gure 2。通过共焦显微镜观察MSC线粒体转移到MDM的可视化 。A.MDM表达CD45标记（蓝色）; B.线粒体用MitoTracker探针（红色）染色; C.共培养24 h后，观察到线粒体阳性TNT，从MSC（箭头）突出长达200μm。从MSC到MDM的线粒体转移通过蓝色和红色染色（粉红色）的共定位来证明。（以10×63放大倍率拍摄图像，比例尺=75μm）。（改编自Jackson e 干细胞。2016年8月; 34（8）：2210-23）
流式细胞仪染色程序
1. 共培养后立即将6孔板放在冰上，然后从培养基中取出
2. 将1ml冰冷的1％FBS PBS加入到细胞共培养物中，并使用细胞刮刀轻轻刮擦整个孔，以便从塑料表面轻轻地分离细胞。
3. 一旦分离，将细胞置于5ml聚苯乙烯圆形底部的流动管中，并将细胞以800×g离心5分钟。
4. 为了在培养和分离后测试细胞的活力，需要包括活/死控制。这需要一个单独的未染色细胞管，并添加活/死标记染色Zombie Aqua（根据制造商的协议使用）。
5. 滗出上清液，将沉淀物浸入约100μl的1％FBS PBS中。
6. 剧烈涡旋，并向细胞中加入2.5μg/1×10 6个细胞的FcR结合抑制剂，并再次旋转。
7. 在黑暗中和冰上休息30分钟。
8. 此后，向细胞悬液中直接加入5μl/1×10 6细胞的抗人CD45（PE）或同型对照（IgG1 kappa），再次涡旋以彻底混合。
9. 在黑暗中和冰上休息20分钟。
10. 然后加入1ml 1％FBS PBS洗涤细胞并处理任何未结合的抗体。彻底旋涡。
11. 离心悬浮液，如前所述，800 x g 5分钟。
12. 弃上清，最后重复洗涤步骤。将沉淀重悬于200μl的1％FBS PBS中，并将细胞置于冰上以准备流式细胞术。
13. 使用FACS DIVA软件进行分析。为了排除MSC-巨噬细胞聚集体，将单个细胞作为W-FSC与A-FSC进行门控，并从中我们将CD45-PE 个体定义为MitoRed-APC ^{MDM和MitoRed-APC ⁺ CD45-PE ^-群体作为MSC（图3）。
  
  Figu re 3。通过流式细胞术将线粒体从MSC转移到 MDM。 A-B。活细胞被门控为W-FSC对A-FSC，并且由此我们定义C.C.CD45-PE不与MSC共同培养的MDM群体为MitoRed-APC阴性。 D. APC ⁺单独MSC铺线对于线粒体是阳性的，但对于巨噬细胞标志物CD45-PE}是阴性的。 E.共培养4小时后，MDM获得了由MitoRed荧光标记APC显示的92％的MSC线粒体。 F.直方图阻碍了MSC群体中MitoRed荧光的减少，表明线粒体对MDM群体的强烈捐赠。（改编自Jackson e 干细胞。 2016年8月34（8）：2210-23）
细菌培养和吞噬分析
1. 用储存的大肠杆菌K1型菌株（无菌LB肉汤/15％甘油）的等分试样接种15ml LB肉汤，并在37℃下孵育以生长过夜培养物。
2. 使用24孔板与MDM和MSC建立直接共培养（见表1的种子密度）。
3. 对于E。大肠杆菌，1×10 8个菌落形成单位（CFU/ml）的总活菌数等于600nm处的约0.25-0.3的光密度（OD）。 >
4. 旋转15,000 x g的细菌5分钟，并使用无菌的1 ml HBSS重新悬浮沉淀。
5. MDM和MSC共培养24小时后，使用感染的多重感染10（MOI 10，参见注释4进行MOI计算）感染细胞，使用HBSS作为载体对照。
6. 在37℃，5％CO 2孵育4小时。
7. 此后，从细胞中取出上清液，用于定量细胞外细菌，并在无菌PBS中稀释10倍至10"-6"。
8. 将3 x 20μl每次稀释的斑点移至LB琼脂上，并在37℃下孵育过夜
9. 细胞内细菌用1 ml无菌PBS洗涤细胞3次，抽吸洗涤，然后加入300μg/ml庆大霉素（稀释于1％FBS RPMI），每孔100μl，37℃孵育1小时以杀死粘附细菌
10. 此后，将细胞在1 ml无菌PBS中洗涤3次，抽吸洗涤，加入100μl0.5％皂角蛋白溶解细胞，使细菌完好无损。
11. 5分钟后，向每个孔中加入900μl无菌PBS稀释皂苷，再次重复稀释，每次稀释。 37℃培养板。
12. 24小时内计算CFU/ml（图4D-4G）。
  
  图4.细胞松弛素B阻断TNT介导的线粒体转移，从而阻止MSC对MDM的功能影响。A.共焦显微镜显示共培养中具有MDM（蓝色）的独特的心轴MSC形状（红色）。 TNT显示具有强大的线粒体转移到MDM。 B.细胞松弛素B预处理MSC抑制肌动蛋白丝延长，导致TNT结构丧失而呈现圆形。由于MSC到MDM的可能的微泡分泌（放大倍率为10×63，比例尺=50μm），线粒体转移仍然是明显的。 C.细胞松弛素B处理MSC显示，在共培养的MDM中，MitoRed平均荧光强度（MFI）降低了50％（* Mann Whitney U检验）。 D.共培养的大肠杆菌感染4小时后，未经处理的MSC显着减少细胞外CFU，同时在巨噬细胞中同时升高细胞内CFU，通过用分离的MSC线粒体刺激（F + G）。 H.这种作用与细胞松弛素B处理的MSC完全消除，因为即使在其存在下，MDM吞噬作用仍然不受影响。（改编自Jackson等人，Stem Cells，2016 Aug; 34（8）：2210-23）

数据分析

使用96孔和24孔板进行体外实验，一式三份进行，其中计算了至少3次独立实验的±SD。对于流式细胞术，使用FlowJo软件版本7计算中值荧光强度。通过绘制频率分布的直方图并使用GraphPad Prism 5中的D'Agostino和Pearson Omnibus正态性测试来测试数据的正常性。参数数据的比较由Student's em> t -test，多组的单向或双向ANOVA。然后使用Bonferroni方法进行事后分析，检验其中的显着性。对于非参数数据，Mann Whitney U和Kruskal Wallis测试与Dunn's方法一起用于后测试。当P 时考虑统计学意义0.05，所有数据显示为平均值±SD。所有统计分析均使用GraphPad Prism版本5进行。以上所有统计信息和支持文档均可在Jackson等人的中找到，干细胞。 2016年8月34（8）：2210-23，URL： http ：//onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/stem.2372/full 。

笔记

5分钟的孵育步骤允许单核细胞粘附到血细胞计数器，并且容易区分淋巴细胞。单核细胞出现"模糊"，"splodgy"或"鬼样"，而淋巴细胞看起来更清晰和更清晰。在原始悬浮液细胞太密的情况下，需要1:10或1:20的稀释度来正确地观察单核细胞。
由于MitoTracker探针以还原的形式提供，它可能对血清中的氧化酶敏感，因此染色溶液由高达1％的FCS含量组成，以允许最大染色电位（ https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/M22426 ）
在1％FBS RPMI培养基中进行MSC和MDM共培养的所有刺激实验。
计算感染的多重性MOI
对于E。大肠杆菌K1，600nm处的光密度为0.25-0.3等于大约1×10 8 CFU/ml细菌。这对于大肠杆菌的每个菌株以及对于不同类型的细菌而言是不同的。因此，开始细菌工作时，必须进行生长曲线（CFU/ml对时间）和吸光度（OD）对CFU/ml的准确估计细菌生长速率，以及OD如何随细菌浓度而变化。一旦建立，可以估计MOI。这是每个感染中每MDM添加的细菌细胞数。见下面的例子初始MDM接种密度= 3×10 5个细胞（24孔板）
起始OD 600nm（0.25-0.3）= 1×10 8 cfu/ml的E。大肠杆菌
因此，MOI 1 = 1×10 5。大肠杆菌（1个细菌细胞：1个MDM细胞）
MOI 10 = 1 x 10 ⁶ CFU/电子。大肠杆菌（10：1）
MOI 100 = 1 x 10 ⁷ CFU/电子。大肠杆菌（100：1）

食谱

完成1％FBS RPMI
500毫升RPMI 1640
5ml FCS（1％）或50ml FCS（10％）
5毫升Pen-Strep（1％）
完成RPMI GM-CSF
500毫升RPMI 1640
50ml FCS（10％）
5毫升Pen-Strep（1％）
10 ng/ml GM-CSF
完成α-MEM
500 mlα-MEM
5ml FCS（1％）或80ml FCS（16.5％）
5毫升Pen-Strep（1％）
5 ml L-谷氨酰胺（1％）
线粒体染色溶液（1％FBSα-MEM MITO ）
500 mlα-MEM
5 ml FCS（1％）
5毫升Pen-Strep（1％）
5 ml L-谷氨酰胺（1％）
200 nM MitoTracker深红色FM探头
细胞松弛素B溶液（1％FBSα-MEM CYTO ）
500 mlα-MEM
5 ml FCS（1％）
5毫升Pen-Strep（1％）
5 ml L-谷氨酰胺（1％）
500nM细胞松弛素B或相同体积的DMSO（载体对照）
1％FBS PBS
50ml无菌PBS
0.5ml FCS（1％）
4％多聚甲醛（PFA）
一个。向50ml蒸馏的H 2 O（ddH 2 O）中加入4g多聚甲醛
湾向溶液中加入1ml 1N NaOH，并在60℃加热块加热至PFA溶解 C。向混合物中加入10毫升10倍的PBS，并使其冷却至室温天。然后用1N HCl调节pH至7.4 即使用ddH 2 O
将混合物的最终体积调整至100ml F。使用0.45μM膜过滤溶液并清除碎屑。等分试样可在-20°C下储存3-6个月
强和弱块免疫荧光染色
强阻滞：45ml PBS + 5ml NGS（10％）
弱块：49ml PBS + 1ml NGS（2％）
0.5％皂角苷
50毫克皂苷粉
10ml无菌PBS

致谢

这项工作由英国医学研究理事会MR/L017229/1（ADK），NHLBI HL51854（MAM）资助。这项工作中使用的一些材料由德克萨斯A& M健康科学中心医学院提供，用于再生医学研究所Scott&白人通过NCRR的NIH授予，授予＃P40RR017447。这个协议是从我们的出版物（杰克逊等人，2016年）改编而来。

参考

Ahmad，T.，Mukherjee，S.，Pattnaik，B.，Kumar，M.，Singh，S.，Kumar，M.，Rehman，R.，Tiwari，BK，Jha，KA，Barhanpurkar，AP，Wani，MR ，Roy，SS，Mabalirajan，U.，Ghosh，B.and Agrawal，A。（2014）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24431222"target ="_ blank"> Miro1调节细胞间线粒体转运增强间充质干细胞的挽救功效。 EMBO J 33（9）：994-1010。
de almeida，MC，Silva，AC，Barral，A.and Barral Netto，M。（2000）。人类外周血单核细胞分离的简单方法 Mem Inst Oswaldo Cruz 95（2）：221-223。
Dominici，M.，Le Blanc，K.，Mueller，I.，Slaper-Cortenbach，I.，Marini，F.，Krause，D.，Deans，R.，Keating，A.，Prockop，D.and Horwitz， E.（2006）。定义多能间充质的最小标准基质细胞国际细胞治疗学会立场声明。 细胞疗法 8（4）：315-317。
Guilliams，M.，De Kleer，I.，Henri，S.，Post，S.，Vanhoutte，L.，De Prijck，S.，Deswarte，K.，Malissen，B.，Hammad，H.and Lambrecht，BN （2013）。从分化的胎儿单核细胞中发展出肺泡巨噬细胞通过GM-CSF在生命的第一周进入长寿命的细胞。 J Exp Med 210（10）：1977-1992。
Gupta，N.，Krasnodembskaya，A.，Kapetanaki，M.，Mouded，M.，Tan，X.，Serikov，V.and Matthay，MA（2012）。< a class ="ke-insertfile"href = "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22250097"target ="_ blank">间充质干细胞增强鼠大肠杆菌肺炎的生存和细菌清除率。胸部 67（6）：533-539。
Gupta，N.，Su，X.，Popov，B.，Lee，JW，Serikov，V.and Matthay，MA（2007）。< a class ="ke-insertfile"href ="http： .ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17641052"target ="_ blank">骨髓间充质干细胞的肺内递送改善了小鼠的生存并减轻内毒素诱导的急性肺损伤。 Immunol 179（3）：1855-1863。
伊斯兰教，MN，Das，SR，Emin，MT，Wei，M.，Sun，L.，Westphalen，K.，Rowlands，DJ，Quadri，SK，Bhattacharya，S.and Bhattacharya，J。（2012）从骨髓来源的基质细胞到肺泡的线粒体转移保护针对急性肺损伤。 Nat Med 18（5）：759-765。
Jackson，MV，Morrison，TJ，Doherty，DF，McAuley，DF，Matthay，MA，Kissenpfennig，A.，O'Kane，CM和Krasnodembskaya，AD（2016）。通过隧道纳米管的线粒体转移是间质干细胞在体外增强巨噬细胞吞噬作用的重要机制和体内模型的ARDS。干细胞 34（8）：2210-2223。
Krasnodembskaya，A.，Samarani，G.，Song，Y.，Zhuo，H.，Su，X.，Lee，JW，Gupta，N.，Petrini，M。和Matthay，MA（2012） class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22427530"target ="_ blank">人类间充质干细胞减少小鼠革兰氏阴性败血症的死亡率和菌血症部分通过增强血液单核细胞的吞噬活性。 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 302（10）：L1003-1013。
Krasnodembskaya，A.，Song，Y.，Fang，X.，Gupta，N.，Serikov，V.，Lee，JW和Matthay，MA（2010）。人间充质干细胞的抗菌作用部分来自抗菌肽LL-37的分泌。 em>干细胞 28（12）：2229-2238。
Lee，JW，Krasnodembskaya，A.，McKenna，DH，Song，Y.，Abbott，J。和Matthay，MA（2013）。< a class ="ke-insertfile"href ="http： ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23292883"target ="_ blank">人类间充质干细胞在活细菌损伤的人类肺部的治疗作用。 Respir Crit Care Med 187（7）：751-760。
Li，X.，Zhang，Y.，Yeung，SC，Liang，Y.，Liang，X.，Ding，Y.，Ip，MS，Tse，HF，Mak，JC and Lian，Q.（2014） ; 诱导多能干细胞衍生的间充质干细胞的线粒体转移至气道上皮细胞减少香烟烟雾诱发的损伤。 Am J Respir Cell Mol Biol 51（3）：455-465。
Liu，K.，Ji，K.，Guo，L.，Wu，W.，Lu，H.，Shan，P.和Yan，C.（2014）。间充质干细胞通过隧道在体外缺血再灌注模型中拯救受损的内皮细胞纳米管像结构介导的线粒体转移。 Microvasc Res 92：10-18。
美国，SH，Haitsma，JJ，Dos Santos，CC，Deng，Y.，Lai，PF，Slutsky，AS，Liles，WC和Stewart，DJ（2010）。间充质干细胞减少炎症，同时增强细菌清除率，提高脓毒症的生存率。 Crit Care Med 182（8）：1047-1057。
Nemeth，K.，Leelahavanichkul，A.，Yuen，PS，Mayer，B.，Parmelee，A.，Doi，K.，Robey，PG，Leelahavanichkul，K.，Koller，BH，Brown，JM，Hu，，Jelinek，I.，Star，RA和Mezey，E。（2009）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19098906"目标="_ blank">骨髓基质细胞通过前列腺素E（2）依赖性地重编程宿主巨噬细胞来减轻脓毒症，以增加其白细胞介素-10的产生。 Nat Med 15（1）： 42-49。
Ware，LB和Matthay，MA（2000）。急性呼吸窘迫综合征。 N Engl J Med 342（18）：1334-1349。
Wilson，JG，Liu，KD，Zhuo，H.，Caballero，L.，McMillan，M.，Fang，X.，Cosgrove，K.，Vojnik，R.，Calfee，CS，Lee，JW，Rogers， Levitt，J.，Wiener-Kronish，J.，Bajwa，EK，Leavitt，A.，McKenna，D.，Thompson，BT和Matthay，MA（2015）。< a class ="ke-insertfile"href = "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25529339"target ="_ blank">用于治疗ARDS的间充质干细胞（基质）：1期临床试验。 Respir Med 3（1）：24-32。
Xu，J.，Qu，J.，Cao，L.，Sai，Y.，Chen，C.，He，L.and Yu，L。（2008）。用于小鼠脂多糖诱导的急性肺损伤的基于间充质干细胞的血管生成素-1基因治疗。 J. Pathol 214（4）：472-481。
Xu，J.，Woods，CR，Mora，AL，Joodi，R.，Brigham，KL，Iyer，S.and Rojas，M。（2007）。预防小鼠骨髓间充质干细胞内毒素诱发的全身反应。 Physiol Lung Cell Mol Physiol 293（1）：L131-141。
Zheng，G.，Huang，L.，Tong，H.，Shu，Q.，Hu，Y.，Ge，M.，Deng，K.，Zhang，L.，Zou，B.，Cheng， Xu，J.（2014）。治疗急性呼吸道同种异体脂肪来源的间充质干细胞的窘迫综合征：随机，安慰剂对照的试验研究。 15：39。