材料和试剂

15毫升Falcon管（康宁，目录号：352196）
1.5ml Eppendorf管（USA Scientific，目录号：1615-5500）
Kimwipes
26 G针（BD，目录号：305111）
旋转色谱柱（例如Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：69700）}
空的和干净的果汁小瓶（Genesee Scientific，目录号：32-109）
Microloader提示（Eppendorf，目录号：930001007）
小瓶（Genesee Scientific，目录号：32-109），含有标准的果蝇食物（轻度发酵）
Microslide（康宁，目录号：2948-75X25）
50果蝇黑腹果蝇成人virgins（罗密欧与Lemaitre，2008），蜕皮后五至七天（见注1）
电子。含有任何氨苄青霉素抗性质粒（例如表达GFP）的大肠杆菌-DH5α

pEGFP（ https://www.addgene.org/vector-database/2485/）
pET-GFP-C11（ http://www.addgene.org/30183/）

LB肉汤（Fisher Scientific，目录号：BP1426-500）
氨苄青霉素（200mg/ml）（Sigma-Aldrich，目录号：A9518）
从100％乙醇中稀释70％乙醇（Pharmco-AAPER，目录号：111000200）
矿物油（Fisher Scientific，目录号：O121-1）
氯化钠（NaCl）（Fisher Scientific，目录号：S271）
氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4·7H 2 O）（Sigma-Aldrich，目录号：S9390）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Fisher Scientific，目录号：S397-500）
1x PBS（见食谱）

设备

37°C振荡孵化器（Eppendorf，New Brunswick ^{TM，型号：Innova ^® 44）}

分光光度计（Molecular Devices，型号：SpectraMax M2）

硼硅玻璃毛细管（WPI，目录号：TW100-4）

离心机能够旋转Falcon管（Eppendorf，型号：5804 R）

火焰/棕色微量吸取器（Sutter Instrument，型号：P-97）

迷你台式离心机（Fisher Scientific，型号：Fisherbrand ^TM标准微型离心机，目录号：05-090-100）

微型注射器（尼康仪器，目录号：PLI-188） - 需要氮气
注意：应该有脚踏板注射。
25℃培养箱（BioCold Environment，型号：BC49-IN）
麻醉飞垫（Genesee Scientific，目录号：59-119）
小刷子
解剖显微镜（Leica）

软件

Prism（Graphpad）软件

程序

E的准备大肠杆菌悬浮液

将50毫升LB肉汤与E.在无菌条件下从LB琼脂平板上培养大肠杆菌菌落。
加氨苄青霉素（最终200μg/ml）
在37℃下振荡孵育过夜。使用分光光度计测量600nm处的光密度（OD 600）。

用2毫升LB肉汤稀释500微升等份的细菌超夜悬浮液5倍
用肉汤和肉汤单独测量稀释细菌的OD <600>。
用肉汤从细菌中减去新鲜LB肉汤的OD 600，并计算过夜培养物的OD 600。

用LB肉汤稀释超过50 ml的细菌培养物至OD 600/0.1。

在室温下，将Falcon试管中的50ml细菌悬浮液4,000 x g旋转10分钟。
滗水LB肉汤。
通过涡旋重悬于50ml PBS中。
用PBS调整至OD 600 <0.1>。

热灭菌（可选;见注2）

将1ml细菌悬浮液等分至1.5ml Eppendorf管中
在65℃孵育20分钟。
细菌溶液现在可以进行注射。

注射针的制备

将玻璃毛细管放入微量拔出器。
运行程序来创建如针图所示的针尖（图1）。

斜坡+5，拉力= 90，速度= 70，延迟= 70

图1.锥形注射针。箭头表示打破它的首选位置。

将Kimwipe拉伸到Falcon管上，用针刺穿Kimwipe，以打破针尖。

飞行灭菌

使用小针（26 G）在旋转柱的纸过滤器上戳三到四个孔，然后放回收集管。
将25只麻醉的苍蝇添加到一个旋转柱（图2）

图2.飞行灭菌的旋转柱。将25只苍蝇装入旋转柱（S）并用70％乙醇覆盖。旋转柱被放置在收集管（C）中以在快速旋转期间包含离心机中的洗涤溶液的流动。苍蝇由底部的纸过滤器保留在旋转柱中。
加入700μl70％乙醇
快速旋转迷你台式离心机（〜3-4秒）。
从收集管中取出旋转柱，倒出流经，并将旋转柱放回收集管中
重复乙醇洗涤步骤3c-3e。
用700μl无菌水冲洗。
Quickspin在迷你台式离心机上（〜3-4秒）。
重复水冲洗步骤3g和3h。
折叠Kimwipe并放在空的飞行小瓶中。
用Kimwipe将苍蝇放入小瓶中，插入并放置在25°C，直到苍蝇恢复。

注射体积的校准（见注3）

使用Microloader提示将1μl细菌溶液装入拉针。
将针连接到微型注射器。
调整微注射器压力，注射时间达到每次注射50 nl。

我们的设置的典型起始值：
1）平衡压力= -0.2 psi - 应该是中立的。
2）注射压力= 15 psi。
3）注射时间= 2毫秒。
校准：将一滴矿物油放在微滑坡上。
将细菌溶液注入油中以确定每次注射nl（装满1μl的针头应产生20个相等大小的液滴，每个为50nl）。
调整注射时间和压力，直到注入所需的量。
针头之间的最佳微型注射器值将略有不同。

注射灭菌的苍蝇（见注释4和5）

用70％乙醇灭菌飞垫，让其干燥。
将灭菌的苍蝇放在飞垫上。
在解剖显微镜下，用小笔刷将腿部放在适当位置。
用另一只手握住注射杆和针头。
将针插入固定飞行的图形中（图3）
使用脚踏将细菌溶液注入飞行 - 可听到蜂鸣声将确认。
重复一遍，直到所有苍蝇都被注射

图3.用细菌悬浮液注射苍蝇麻醉的苍蝇用刷子固定，使用装有细菌悬浮液的拉制玻璃针（参见图1）注射。

孵化苍蝇并监测生存

将≤15个注射的苍蝇放入含有新鲜标准果蝇的培养基的小瓶中小瓶应轻度发酵，含有不超过1.5毫升的飞行食物。这样可以最大限度地减少苍蝇卡在酵母中或小瓶与食物侧面的危险，因为食物在稍后的日子里会变干，并与小瓶分开。
将小瓶放入25℃培养箱中，注意注射后2小时有多少苍蝇活着。不能从注射中恢复的苍蝇应该从数据集和后续分析中舍弃。
每天死亡和生活的苍蝇，每天一次，直到所有人都死亡。对于比E更致病的细菌。大肠杆菌，较短的时间间隔将很重要。
翻转每5天飞入新鲜小瓶。

数据分析

记录的数据输入到用于显示存活曲线的Prism（GraphPad）软件（图4），并分析基因型之间生存差异的统计学显着性。 Log-Rank（Mantel-Cox）检验用于评估存活曲线差异的统计学显着性（图4）。或者，多个Log-rank分析软件包可以在线获取： http://astatsa.com/和 http：//bioinf.wehi。 edu.au/software/russell/logrank 。双方提供有关如何输入数据的详细信息

图4.细菌感染后蝇存活的统计分析实例该图显示注射后的野生型野生型（OreR）或Vps33B突变体的分数， E。大肠杆菌，类似于先前发表的实验（Akbar等人，2016）。使用Log-rank（或Mantel-Cox）测试在Prism中进行统计分析，以确定小于0.0001的P 值。

笔记

应包括野生型果蝇菌株（俄勒冈州R或Canton S）作为注射用的阴性对照组。适当时，使用兄弟和/或父母作为对照。每个基因型的五十只苍蝇的三次重复就足以进行适当的统计分析
重要的是要注意，热灭活可以改变细菌参与不同先天免疫途径的潜力，因为通常隐藏的表位可能会被暴露（Chung and Kocks，2011）。
在针头校准和注射步骤期间遇到这个实验过程中的大多数困难。平衡压力是大多数问题的根源。如果平衡压力设定得太高，结果是细菌溶液的不断渗出导致难以测量注射液滴，排空针头和将细菌溶液滴落在飞行中。注射脚踏板被压下之前，液体不应该脱落。如果平衡压力太低，也会出现问题。低压会导致刚刚注入的液体吸入，几乎没有细菌被注入（这也应该是校准的一部分）。此外，一旦将针插入飞行中，负压将将飞行组织拉入针尖，导致通常通过显微镜看到的阻塞。这将防止脚踏板被推动时进一步注射。将针尖放入细菌溶液中并按下Pico注射器上的"清除"按钮通常可以通过高正压清除针来解决此问题。一旦清除堵塞物，将针尖留在细菌溶液中，并按住"填充"按钮，用负压重新填充针头。一旦针头被校准，也可以在飞行或画笔上或附近注入几滴以获得50nl液滴的大小的良好感觉。 50毫微微滴大概是飞眼的大小。
在开始细菌注射之前，重要的是要进行一系列实验，显示苍蝇不会因针头损伤引起的炎症或从注射培养基而死亡。应对野生型和实验性蝇进行模拟注射，以确定单独的损伤是否足以杀死苍蝇。此外，应该进行无菌PBS的对照注射，以确保苍蝇死于感染。应以与数据分析部分所述细菌注射相同的方式对这些模拟注射进行分析。
上述实验程序已针对DH5αE进行了优化。大肠杆菌。每次注射50 nl，每次飞行约2,000 CFU。如果要使用其他细菌物种，应优化细菌负荷，以确保野生型苍蝇在毒力允许时的存活。

食谱

1x PBS
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
10mM Na 2 HPO 4
1.8mM KH 2 PO 4

致谢

这项工作由NIH Grants EY010199，EY021922支持。
该协议已经从我们之前发表的作品（Akbar等人，2016; Akbar等人，2011）进行了修改和修改。
作者声明没有利益冲突。

参考

Akar，MA，Mandraju，R.，Tracy，C.，Hu，W.，Pasare，C. and Kramer，H。（2016）。 ARC综合征相关的Vps33B蛋白是炎症性内体成熟和信号终止所必需的。免疫性 45（ 2）：267-279。
Akbar，MA，Tracy，C.，Kahr，WH和Kramer，H。（2011）。在果蝇免疫防御期间，全细菌基因是吞噬细胞成熟所必需的。 J Cell Biol 192 3）：383-390。
Chakrabarti，S.，Dudzic，JP，Li，X.，Collas，EJ，Boquete，JP and Lemaitre，B。（2016）。远程控制果蝇中血细胞的肠干细胞活性。 12（5）：e1006089。
Chung，YS和Kocks，C.（2011）。吞噬细胞模式识别受体Eater识别致病微生物。生物化学286（30）：26524-26532。
罗密欧，Y.和Lemaitre，B。（2008）。果蝇免疫：监测方法Toll和Imd信号通路的活性。方法Mol Biol 415：379-394。