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本实验方案简略版
Jul 2009

本文章节


 

Generation of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells (BM-DCs)
培养老鼠骨髓树状细胞   

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Abstract

Generating mouse dendritic cells from bone-marrow progenitor cells is a useful tool to study biological functions of mouse dendritic cells. Dendritic cells are one of the major populations of phagocytes able to activate both innate and adaptive immune cells.

Keywords: Phagocytes (吞噬细胞), Dendritic cells (树突状细胞), In vitro (体外), GM-CSF (GM-CSF)

Materials and Reagents

  1. GM-CSF-transduced B16 cell line
  2. HI FBS (EuroClone, catalog number: EC S0180L )
  3. L-Glutamine (EuroClone, catalog number: EC B3000D )
  4. Penicillin/streptomycin (EuroClone, catalog number: EC B3001D )
  5. IMDM (EuroClone, catalog number: EC B2072L )
  6. Beta-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich, catalog number: M6250 )
  7. B16-GMCSF growth supernatant
  8. Phosphate buffered saline (PBS) (EuroClone, catalog number: ECM9605AX )
  9. EDTA
  10. BMDCs culture medium/conditioned medium (see Recipes)

Equipment

  1. Centrifuges 70 μm-wide cut-off cell strainer
  2. Non-treated cell culture plates
  3. Incubator (37 °C and 5% CO2)
  4. Fluorescence activated cell sortor (FACS)

Procedure

  1. Flush mouse tibiae and femurs with ice-cold PBS through a 70 μm-wide cut-off cell strainer.
  2. Centrifuge 5 min at 450 x g. Resuspend pelleted cells in conditioned medium (supplemented with 10% of growth supernatant of GM-CSF-transduced B16 cells).
  3. Seed 7 x 106 cells in 100 x 20 mm non-treated cell culture plates in 10 ml of conditioned medium.
  4. Incubate at 37 °C and 5% CO2.
  5. On day 4 and 7 add 5 ml of pre-warmed conditioned medium.
  6. At day 8/9 the percentage of CD11c+ cells should be higher than 90% as measured by FACS analysis. BMDCs are then ready for experimental use.
  7. Harvest the supernatant and gently wash the plate once with 5 ml of pre-warmed PBS.
  8. Incubate 2 min with 5 ml of 2 mM EDTA at 37 °C and 5% CO2.
  9. Collect cells, wash once with PBS.
  10. Centrifuge 5 min at 250 x g and resuspend pelleted cells in conditioned medium.

Recipes

  1. BMDCs culture medium recipe (conditioned medium)
    HI FBS - 10%
    L-Gln - 2 mM
    Penicillin/streptomycin - 50 U/ml
    Beta-mercaptoethanol - 50 μM
    B16-GMCSF growth supernatant - 10%
    IMDM - to volume

Acknowledgments

This protocol is described in our Nature paper (Zanoni et al., 2009). This work was supported by grants from the CARIPLO Foundation, the European Commission 6th Framework Program (MUGEN and DC-THERA contracts), the European Commission 7th Framework Program (TOLERAGE and ENCITE contracts), the Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) and the and the Italian Ministry of Education and Research (COFIN).

References

  1. Zanoni, I., Ostuni, R., Capuano, G., Collini, M., Caccia, M., Ronchi, A. E., Rocchetti, M., Mingozzi, F., Foti, M., Chirico, G., Costa, B., Zaza, A., Ricciardi-Castagnoli, P. and Granucci, F. (2009). CD14 regulates the dendritic cell life cycle after LPS exposure through NFAT activation. Nature 460(7252): 264-268.

简介

获得骨髓祖细胞来源的的小鼠树状细胞是一种研究小鼠树状细胞生物学功能的有用工具,这个实验方法在我们《自然》杂志的论文上有记载(请看参考文献)。
通讯作者: Ivan Zanoni and Francesca Granucci.

关键字:吞噬细胞, 树突状细胞, 体外, GM-CSF

材料和试剂

  1. GM-CSF转导的B16细胞系
  2. HI FBS(EuroClone,目录号:EC S0180L)
  3. L-谷氨酰胺(EuroClone,目录号:EC B3000D)
  4. 青霉素/链霉素(EuroClone,目录号:EC B3001D)
  5. IMDM(EuroClone,目录号:EC B2072L)
  6. β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich,目录号:M6250)
  7. B16-GMCSF生长上清液
  8. 磷酸盐缓冲盐水(PBS)(EuroClone,目录号:ECM9605AX)
  9. EDTA
  10. BMDC培养基/条件培养基(参见配方)

设备

  1. 离心机70μm宽截止细胞过滤器
  2. 未处理的细胞培养板
  3. 培养箱(37℃和5%CO 2)
  4. 荧光激活细胞分选机(FACS)

程序

  1. 用冰冷的PBS冲洗小鼠胫骨和股骨通过一个70微米宽的截止细胞过滤器。
  2. 在450×g离心5分钟。 在条件培养基(补充有10%GM-CSF转导的B16细胞的生长上清液)中重悬沉淀的细胞。
  3. 在10ml条件培养基中,在100×20mm未处理的细胞培养板中种7×10 6个细胞。
  4. 在37℃和5%CO 2下孵育
  5. 在第4和7天加入5ml预热的条件培养基
  6. 在第8/9天,通过FACS分析测量,CD11c +细胞的百分比应当高于90%。 然后BMDCs准备好进行实验使用。
  7. 收获上清液,用5ml预热的PBS轻轻洗涤板一次
  8. 在37℃和5%CO 2下用5ml的2mM EDTA孵育2分钟。
  9. 收集细胞,用PBS洗一次。
  10. 在250×g离心5分钟,并在条件培养基中重悬沉淀的细胞。

食谱

  1. BMDC培养基配方(条件培养基)
    HI FBS-10%
    L-Gln-2mM 青霉素/链霉素 - 50U/ml β-巯基乙醇 - 50μM
    B16-GMCSF生长上清液-10%
    IMDM - 到量为

致谢

这个协议在我们的自然论文中描述(Zanoni等人,2009)。 这项工作得到了CARIPLO基金会,欧盟委员会第六框架计划(MUGEN和DC-THERA合同),欧盟委员会第七框架计划(TOLERAGE和ENCITE合同),意大利航空公司 和意大利教育研究部(COFIN)。

参考文献

  1. Zanoni,I.,Ostuni,R.,Capuano,G.,Collini,M.,Caccia,M.,Ronchi,AE,Rocchetti,M.,Mingozzi,F.,Foti,M.,Chirico,G.,Costa ,B.,Zaza,A.,Ricciardi-Castagnoli,P。和Granucci,F。(2009)。 CD14调节LPS暴露后通过NFAT活化的树突细胞生命周期。 自然 460(7252):264-268
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Copyright: © 2012 The Authors; exclusive licensee Bio-protocol LLC.
引用:Granucci, F., Ostuni, R. and Zanoni, I. (2012). Generation of Mouse Bone Marrow-Derived Dendritic Cells (BM-DCs). Bio-protocol 2(12): e226. DOI: 10.21769/BioProtoc.226.
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