材料和试剂

Falcon 50ml圆锥形离心管（例如Corning，Falcon，sup。，目录号：352070）
滤纸，2号，Ø9厘米（Advantec，目录号：00021090）
直径为100mm的灭菌塑料盘皿（例如BioLiteφ100TC Dish，Fisher Scientific，目录号：12-556-002）
制造商：Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM ，目录号：130182。
Eppendorf 微量离心管（1.5ml）（例如，Fisher Scientific，目录号：05-408-129）
手术胶带（或石蜡膜）（例如，3M，目录号：1530-1）
厨房铝箔
灭菌的方形塑料盘皿140×100×14.5mm（Eiken Chemical，目录号：AW2000703077）
显微镜幻灯片（例如，Fisher Scientific，目录号：12-549-3）
显微镜盖玻片L x W x D：22 x 70 x 1.0 mm（例如，Fisher Scientific，目录号：10-016-24）
手套
水稻种子（日本粳稻日本晴）
日本。um种子
商业次氯酸盐溶液（Kao Japan）（约6％次氯酸钠）
氢氧化钾（KOH）（Sigma-Aldrich，目录号：484016）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
水（Milli-Q级）
碘化丙啶（Sigma-Aldrich，目录号：P4170）
Murashige和Skoog盐（预混合）（Wako Pure chemical Industries，目录号：392-00591）
蔗糖（Merck Millipore，目录号：107687）
肌醇 - 肌醇（Sigma-Aldrich，目录号：I7508）
2,6-二甲氧基-1,4-苯醌（DMBQ）（Sigma-Aldrich，目录号：428566）
琼脂（Merck Millipore，目录号：101614）
二甲基亚砜（DMSO）（和光纯药，目录号：041-29351）
水合氯仿（Sigma-Aldrich，目录号：V000554）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
通用媒体（见配方）
DMBQ储备溶液（10 mM）（见配方）
水合氯醛溶液（见配方）

设备

稻壳（Fujiwara Scientific，型号：测试稻壳）
管旋转器（例如，TITEC，型号：RT-50，目录号：0000165-000）
层流罩（例如，YAMATO SCIENTIFIC，型号：CCV-1300E）
植物生长室（例如，NKsystem，型号：LPH-411SP）
日光白光荧光灯（NEC LIGHTING，型号：FL40SEX-N-HG）
显微镜（Leica Microsystems，型号：TCS-SP5 II）
涡旋振荡器（例如，Scientific Industries，型号：Vortex-Genie2，目录号：G560-SI-0246 2）
手术解剖刀手柄（例如，，Swann-Morton，目录号：0933）
手术刀片11号（例如，，Swann-Morton，目录号：0303）
不锈钢镊子（例如，Sigma-Aldrich，目录号：F4142-1EA）
半分析天平（例如，，Shimadzu，型号：AUW220D）
水浴（例如，，Fisher Scientific，型号：Fisher Scientific ^TM Isotemp ^TM通用豪华水浴，目录号：S28124）
光立体显微镜（例如，卡尔·蔡司，型号：Stemi-2000）
光学显微镜（例如，奥林巴斯，型号：BX53-P）
高压灭菌器（例如，，平山，型号：HG系列）

程序

水稻种子发芽

用稻壳从水稻种子中取出种皮。
注意：如果米糠不可用，可以通过用镊子或手紧紧捏住种子的and子并将其推下来逐一除去种皮。
将外套去除的种子放在50ml塑料管中。
注意：每根管子最多可达20-30粒。
为了对水稻种子进行表面灭菌，将其浸入含0.1％（v/v）吐温20的50％（v/v）商业次氯酸盐溶液（最终溶液中约3％次氯酸钠）中。速度5分钟，将塑料管放置在管旋转器中25分钟，设定为10-20 rpm。
从这一步骤，程序应在无菌层流罩中进行，用无菌去离子水（Milli-Q级）将种子洗涤5次。
将表面灭菌的种子转移到放置在塑料培养皿（Ø100mm）中的一片潮湿的滤纸上。对于50粒种子，使用12-15毫升无菌水来润湿滤纸
将种子置于26℃，16小时光照条件下，8小时黑暗条件下的生长室中放置1周，其光照强度为约701摩尔/平方米/秒，由白光荧光灯（FL40SEX-N-FL，NEC，日本）

图1.水稻根系分泌物处理 A.由解剖刀切除的一周龄水稻根部固定在琼脂块中。将琼脂块切成小块（〜2×4cm），每个包含约20-25mg切除的水稻根。它被放置在P上。日本植物保持垂直位置2周。（A）放大图。 C.日本ium根无根诱导处理; D和E.沿着P形成的诱导的吸烟（由白色箭头指向）。日本根F.用水合氯醛溶液清洗根组织，并在显微镜下观察。 G和H.在转基因猪中形成的烟炱。在共聚焦徕卡TCS-SP5 II显微镜下拍摄合并过滤器（G）和YFP过滤器（H）照片的具有构建体的ProPjYUC3：3xVENUS-N7-Pro35S：RFP 。有关详细信息，请参见参考文献Ishida等人。（2016）。白色条表示1厘米，黑色条纹为2.5毫米。

P上。日本种子发芽

将种子放在1.5ml塑料管中（每个管最多约100个种子）
通过浸入10％（v/v）商业次氯酸盐溶液（〜0.6％次氯酸钠在最终溶液中）来灭菌种子表面。将管置于旋转振荡器中，最大速度设定1分钟。用新的漂白溶液替换溶液，并保持在旋转振荡器中9分钟。
从这个步骤，程序应该在无菌层流罩中进行，用无菌去离子水洗种子五次。
将种子浸入无菌去离子水中。将它们在4℃的黑暗中保持过夜。
使用1毫升的提示，在包含GM培养基的方形盘子的顶部逐一种植种子，每个板块约12-15个种子。用手术胶带密封方形板，并用铝箔盖住。保持种子在黑暗中三天以刺激发芽。
去除部分铝箔，保持根部的覆盖。
将正方形盘垂直放置在25℃，16小时光照和8小时黑暗条件下的生长室中2周。
注意：让寄生植物垂直生长是很重要的，以避免根部渗入琼脂培养基。

水稻根系渗出物引起的。。

使用灭菌的镊子和解剖刀在灭菌的盘碟（Ø9厘米）上，从1周龄的水稻幼苗上切下根部。
测量根鲜重。对于180毫克鲜重的根组织，20-25切除根是必要的
在灭菌的盘碟（Ø9厘米）中，放置180毫克鲜重的水稻根和5毫升水，从水稻种子发芽的板上。
使用消毒的手术刀将根切成小块（约1-3毫米长）。
加入20毫升0.8％（w/v）琼脂，在60℃的水浴中加热
混合均匀，直到根部分布均匀分布在琼脂上
让琼脂固化30分钟。
将琼脂块切成大约〜2 x〜4厘米，并将它们放在生长在GM培养基上的寄生植物根上。琼脂块的大小应足以覆盖寄生根。（图1A和1B）
注意：当使用转基因根时，将它们转移到装有30ml含有抗生素头孢噻肟（300μg/ml）的0.8％（w/v）琼脂的平板皿（Ø9cm）中。含有切碎的水稻根和渗出物的琼脂块应放在转基因根上。
吸管将在24小时内形成（图1D至1F）。显示了形成ust ust的转基因根的实例（图1G至1H）
取出含有水稻根的琼脂，并计算立体显微镜下的吸烟数。

由DMBQ引起的呕吐物

将10mM DMBQ储备液稀释至10μMDMBQ工作溶液，在无菌去离子水中。
在1周龄的P的根部顶部滴下7ml（每片）10μMDMBQ溶液。日um um>。。。。。。。。。。。。用手术胶带（或Parafilm）密封板。
用铝箔覆盖根部。
将板在水平放置在26℃，16小时光照和8小时暗条件下的生长室中，保持根部分用铝箔覆盖。
在24小时内，沿着寄生虫根部形成鲈鱼。在立体显微镜下计数出汗数（图2）。
注意：日本um根对损伤非常敏感。如果在手术过程中造成组织损伤，可能会改变形成的痰液的百分比。

图2. DMBQ诱导的吸烟。 A.两周龄的
日本; um>>;;;;;;;;;;;用10μMDMBQ处理B. 日本麻药（B）放大照片。沿着P形成的DMBQ诱发的吸烟（由白色箭头指向）。日本根/转基因在共焦徕卡TCS-SP5 II显微镜下拍摄的日本照片。在差异干涉对比滤波器和YFP滤波器下观察到用构建体ProPjYUC3：3xVENUS-N7-Pro35S：RFP（Ishida等人，2016）转化的根。合并图片（E）和YFP滤镜（F）下的图片。携带构建体CYCB1; 2 pro :: YFP的组织用400μg/ml碘化丙啶染色以突出根细胞形态。详细信息参见Ishida等人。（2011）。注意，该方法以圆形形式发展，这与图1所示的基于琼脂的方法不同。白色条代表1mm，黄色条2.5mm。

用水合氯醛澄清根组织*
1. 在水合氯醛水溶液中浸泡过夜，室温下浸泡过夜。
2. 要在显微镜下检查痰液，将它们放在玻璃载玻片上，并将滑盖覆盖在顶部。
注意：水合氯醛是一种有害的试剂。请务必使用手套进行操作并将其处理在相应的容器中。

数据分析

为了获得准确的结果，我们建议至少进行三次独立实验，每次重复使用10到15个植物。受伤根的植物应从分析中排除。
在立体显微镜下观察个体植物中存在或不存在的烟草，并计算具有烟草的植物的百分比。或者，计算每个植物形成的吸烟数量，并分析每次重复的平均数据。
在转化的转基因根的情况下，检查在立体显微镜下的存在，并确定个体转基因根与寄生器官的百分比。计算每个生物实验的每株植物的平均吸烟量。

笔记

受伤的根部损害了他们在P中开发痰液的能力。血吸虫。因此，只有健康的根才应该考虑进行数据分析。

食谱

通用媒体
1x Murashige和Skoog盐（预混）
1％（w/v）蔗糖 0.01％（w/v）Myo - 肌醇
0.06％（w/v）2-（N-吗啉代）乙磺酸（MES）一水合物
0.8％（w/v）琼脂
用1N KOH调节pH至5.7 通过高压消毒灭菌
对于每个正方形板，将100ml转基因培养基倒入
含有培养基的板在4℃下储存最多3-4天
DMBQ储备溶液（10 mM）

将16.8mg 2,6-二甲氧基-1,4-苯醌溶于10ml二甲基亚砜（DMSO）中。
将DMBQ溶液等分于1.5ml灭菌塑料管中
用铝箔覆盖保护光线
存储在-20°C直到使用时刻

水合氯解决方案
8克水合氯醛
1毫升甘油
2ml去离子水在室温下存放直至使用时刻

致谢

该协议是从我们发表的作品（Ishida等人，2016）和（Albrecht等人，1999）中改编而成。这项工作得到了MEXT KAKENHI赠款（S.S.的编号24228008和15H05959，S.Y.的第25114521号，25711019号和90425128716号）和博士学位的支持。奖学金计划（MEXT to JKI）。

参考

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