材料和试剂

无菌细胞刮刀（VWR，目录号：89260-224或89260-222）
注意：产品"89260-224"已经停产。
0.2μm注射器过滤器（聚醚砜膜，例如，Pall，目录号：4652）
吸管尖端
1.7ml微量离心管
无菌注射器
尺寸适合NanoSIMS夹持器（例如，5×5mm，Ted Pella，目录号：16008）的硅（Si）晶片
无菌组织研磨机（Fisher Scientific，目录号：02-542-08）
生物膜文化
注意：我们检查了一种单体混合物种生物膜，但是，该方案适用于大多数生物膜类型的分析，条件是水性底物可以添加到样品中，具有均匀的分布。我们的生物膜和培养程序的详细描述可以在Stuart et al。，2016a找到。
稳定的同位素标记化合物，适合于支持感兴趣的生物体的生长或代谢（例如，99原子百分比过量[atm％] 13 C/sub> 3 ，Cambridge Isotope Laboratories，目录号：CLM-441-1）
用于生长的合适的限定培养基（例如，在Stuart等人，2016a）中描述的修饰的人造海水基础[ASN]培养基
50％乙醇（EtOH）
37％甲醛溶液（Sigma-Aldrich，目录号：252549）
10x磷酸缓冲盐水（Sigma-Aldrich，目录号：P5493）
氯化钠（NaCl）
无菌MilliQ水
4％PFA（见食谱）
无菌10％氯化钠（NaCl）溶液（参见食谱）
改性人造海水基（ASN）介质配方（含硝酸盐）（见配方）

设备

Dounce均质机（WHEATON，目录号：357546）
微量离心机，能够产生高达15,000 x g的可变转速
同位素比质谱仪（例如，ANCA-IRMS，PDZE Europa Limited，Crewe，England）
用于生物膜培养的室（例如，Pyrex密封烧瓶，Corning，PYREX，目录号：4985-1L）
孵化器（适合培育感兴趣的生物体）
解剖显微镜（例如，Fisher Scientific，型号：Fisher Scientific ^{TM 420系列，目录号：11-350-124）}
干燥器柜（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific，Supest TM），目录号：5317-0070）
荧光光学显微镜（例如，Leica Microsystems，型号：Leica DMI600B）
金刚石或硬质合金划片（例如，Ted Pella，目录号：54412）
金（或其他导电金属）溅射涂布机（例如，Cressington，型号：溅射涂布机108）
NanoSIMS 50或50 L（AMETEK，Cameca，型号：NanoSIMS 50或NanoSIMS 50 L）
扫描电子显微镜（SEM）具有超过50nm分辨率和显微照片记录能力（例如FEI，型号：FEI Inspect F SEM）

软件

离子图像数据处理软件（ e ，LIMAGE，L. Nittler，Carnegie Institution of Washington，华盛顿特区，美国; ImageJ与MIMS插件; Look @ NanoSIMS [Polerecky et al。，2012]或类似的）

程序

稀土同位素底物生成，生物膜孵育，硅晶片固定和制备
1. 产生稀有的同位素富集的细胞外有机物质（EOM）
  注意：用于同位素标记的底物将取决于被测试的具体实验的假设。在这里，我们描述了聚合稀有同位素标记底物EOM的生成，但底物也可以是简单定义的化合物（例如，13 C-氨基酸，葡萄糖，碳酸氢盐或^{硝酸铵，铵）。使用的基材将依赖于正在测试的假设。}
2. 将细胞接种到重复的优选培养室中，培养用于生物膜发育，测量随时间的生长，对于我们的蓝藻生物膜的生长条件的详细描述可以在Stuart等人，2016b。
  注意：
  1. 尽可能地减少生物膜培养体积，同时保持相关条件，以节省在步骤A1中生成的稳定同位素底物（在这种情况下为EOM）的使用。
  2. 为了获得元素摄取（μgC或N固定）的定量测量，所有生物膜社区成员的生物量测量是必要的。可以使用固定生物膜的子部分的显微镜来产生生物体积测量（Stuart等，2016b）。
  3. 推荐使用完全限定的培养基（例如，ASN [Stuart等，2016a]），其中所有C和N源都是已知的，从而可以估计生物膜C和N预算。
3. 将稳定的同位素标记的底物添加到天真的生物膜培养物中
  1. 向未标记的生物膜培养物中加入同位素稀有生长底物（步骤A1）（步骤A2）。
  2. 控制治疗应包括（至少）：
    1. 杀死对照 - 在实验开始前，将4％PFA（见下文配方）修复生物膜1小时，冲洗固定剂，然后与其他活体样品一样处理。
    2. 不添加稳定同位素的对照。
    3. 可选：其他控制措施来解决有关特定代谢的假设（例如，在特定抑制剂的存在下）
  3. 在选定的时间点，从生物膜文化中清除废弃的媒体注意：时间点取决于目标的代谢率和测试生物体的生长速率。我们的时间点从1小时到24小时，基于我们的生物体的生长速度（约0.1天^-1）和基于^{13的C固定体积率碳酸氢盐掺入（IRMS测量）。}
  4. 可选择：保存用于进一步分析的用过的介质 - 过滤0.2μm聚醚砜注射器过滤器，并将滤液冷冻至-80°C。
4. 修复组织以保持超微结构
  1. 向生物膜组织中加入4％PFA，并在室温下孵育1小时或在4℃下孵育过夜。
    注意：戊二醛或乙醇是可接受的替代品。
  2. 去除4％的PFA并用无菌H 2 O 2小心地冲洗生物膜至少3次。
    注意：彻底清除盐和固定剂很重要，因为这些干扰了NanoSIMS测量。
  3. 在-20℃下将生物膜储存在50％EtOH中，体积足够覆盖生物膜。
    注意：固定生物膜可以在这些条件下储存长达几年。
5. 准备固定生物膜样品用于微量分析和成像
6. 使用溅射涂层机涂覆高导电金属表面的样品
  
  金或铱衣是典型的;目标为5至10nm涂层;较大的细胞或具有增加的地形缓解的制剂更厚。可以使用碳涂层，但会干扰碳同位素测量。
  
  金属涂层对于低浮雕样品（<1μm）不是必需的，但它改善了纳米SIMS中样品的SEM成像和初始成像。
7. 将硅晶片放在支架上
  
  如果SEM室足够大，样品可以放置在NanoSIMS夹具中;否则，在加载到NanoSIMS持有者之前的SEM图像样本
SEM成像

SEM成像对于选择分析目标和确保清除干扰碎片或非靶细胞非常有用。如果以三个尺度（100x，500x和3,000x）收集目标位置的SEM图像，则在SEM中选择的分析位置可以重新定位在NanoSIMS中。还可以使用SEM舞台坐标来重新定位在NanoSIMS光成像系统（CCD摄像机）中太小或不明确的目标;这对于Si晶圆上的大多数细胞分散体是不必要的

将样品放在扫描电镜中。

根据仪器的需要调整光斑尺寸和电压kV;如果样品没有金属涂层，低电压成像可以减少充电。

在低，中，高放大倍数（100x，500x，3,000x）下选择分析目标和图像。

选择多个细丝相邻或重叠的位置，但仍然可以清楚地区分（参见图1B）。
注意：重叠的灯丝将允许在一个分析窗口中分析2-3根灯丝，从而最大限度地提高NanoSIMS分析时间，但是如果它们不能清楚地区分，这将损害分析。

如果感兴趣的是异源细菌细胞，则可以收集高倍放大图像（> 3,000x），以便清楚地显现它们（图1B）。

收集足够的SEM图像以分析每个样品至少20个细丝。
NanoSIMS分析

将样品加载到NanoSIMS
中

样品可能需要1-12小时才能达到必要的真空度，这取决于样品类型，干燥度和细胞材料的密度

使用Cs ⁺分析光束进行C和N同位素的分析。在此模式下提取负二次离子。

调整仪器并设置质量进行所需的分析。为了测量细胞中的¹³ C或¹⁵ N富集，离子质量为24,25,26,27（^{12 ^-，¹³ C ¹² C ^-，¹² C ¹⁴ N ^-和¹² C ¹⁵ N ^-）。以前的工作表明C二聚体（例如，¹² C ₂ ^-）具有优于¹² C单体，更好地符合CN ^-（Pett-Ridge和Weber，2012）的二次质谱仪设置。
质量分辨率（ΔM/M）> 6,800是解决等压干扰的必要条件
应分析参考材料以确保仪器性能正确。这可以简单地是未标记的控件，尽管持续运行的样本可以提高对结果的信心（Pett-Ridge和Weber，2012）。}

选择分析束电流

通常，分析速度是选择光束电流时考虑的主要因素，因为CN ^-是高产量物种，NanoSIMS检测器的最大可持续计数率为每秒25万次，容易从具有1至2pA Cs ⁺的细胞实现。这些设置通常会产生约150 nm直径的分析光束。这个直径设定了分析的最终空间分辨率。

如果需要更高的空间分辨率，则应使用减小分析光束直径并降低光束电流的透镜和光圈设置。

选择并保存位置以分析

首先根据位于CCD相机（光成像）中的点记录一般位置。如果CCD摄像机中所需的目标不能被可视化，则必须定位其他地面标记，并且可以使用SEM图像或坐标变换确定的测量结果以SIMS模式定位目标。

SIMS实时成像是必要的，以确保CCD成像中选择的目标居中在成像领域。

设置分析参数以在每个映射位置使用并进行分析。这包括：

分析栅格的大小，这取决于正在分析的单元格的大小。通常在10 x 10μm和25 x 25μm之间。

像素数，通常基于分析束斑大小（线性像素数）〜2×（光栅大小）/（光点大小）。对于典型的150 nm直径分析光束，对于10 x 10μm的光栅，128 <2>像素对于25 x 25μm的光栅将是合理的。

预分析溅射：通常，在数据采集之前，高电流Cs ⁺光束在样品上被扫描，以增强和稳定来自样品的二次离子计数率。将样品溅射到约为60nm量级的Cs ⁺注入深度的两倍。可以基于溅射速率（ξξ），一次离子束电流（I），溅射时间（ξ），溅射时间），栅格区域（ A ）和溅射深度（ d ）：

对于生物材料，溅射速率可以估计为2.5nmμm2（以下）（ghosal等人，/em>。，2008）。可能需要更长的预分析溅射以从细胞表面去除残留的材料。通过监测计数率和深度的同位素比率，可以凭经验确定溅射的最佳持续时间。

分析持续时间，应根据最小目标所需的计数数量进行计时，以达到足够的分析精度;小计同位素的10,000个计数将导致〜1％的分析精度。
注意：

确定一致的数据收集参数可能是一个迭代过程，特别是对于新样本，其中富集水平，细胞表面上的残留物质和样本内变异性是未知的。样本可能需要进行分析和检查，之后可能稍作改动，以确保适当的数据收集。

运行非标签和杀死的控件是至关重要的。这些结果用于下面的浓缩计算

数据分析

分析NanoSIMS离子图像需要特殊的软件，可以逐个像素地定量处理图像。几个软件包可用（ e 。 。LIMAGE [L. Nittler，Carnegie Institution of Washington，DC]），包括免费版本。

结果可以基于定量离子图像（例如图1C）或离子比图像（^{12）进行可视化（例如，¹² 13，图1D-1E），每个分析区域。按像素计算比率。}

对于诸如这些的稳定同位素标记实验，数据通常以三角洲符号，次同位素的原子百分数或次要同位素的原子百分比过剩（APE）的比率表示。 APE是一个理想的演示，因为它很简单，直接表示了标签的吸收（见下面的方程式）。虽然在文献中很常见，但是对于高度富集的样品，三角形记数法可能不那么直观。然而，单位的选择不会影响图像或图形的数据可视化。

必须确定目标细胞周围的感兴趣区域（ROI）用于同位素比率的定量（图1C-1E）。 ROI通常是手动绘制的，但自动程序也可以成功。

对于生物膜细菌细胞或蓝藻细丝，可以基于二次电子和/或超细离子图像手绘图像（图1C），这两者都产生了细胞边界的良好指示。检查¹³ C/¹² C和¹⁵ N/¹⁴ N个图像也是有用的，因为这些图像可能会排除剩余标记底物的热点（图1D-1E）

为每个ROI提取同位素比率，不确定性和像素大小。

ROI的原子百分比浓度（APE）可以根据（表1）计算：

APE = [ R _f /（ R _f /（ R _f + 1） - R _{我/sub> /（ R _我 + 1）] x 100％}

是最终比例，使用测量的ROI中的同位素比例（ i e 。，¹³ C/¹² C）。 i 是初始比例，杀死对照或无同位素添加对照中的测定比例。

然后可以计算稳定同位素的净固定（相对于初始稳定同位素含量而引入的稳定同位素的百分比）（Popa a 1 。，2007）为每个ROI和平均值（表1）：

Fxnet = { R _f [1 - R _{sub> /（ R _i + 1）] - R _> /（ R _我 + 1}/{ R /（ R + 1） - R _{>˚F [ - [R <子> 取值 /（ - [R <子>} + 1]} x 100％}

是从NanoSIMS测量（ i C ¹³ C ¹² C计数/¹² C ₂在投资回报率中）。

是初始生物膜中的同位素比率，来自NanoSIMS测量（ i em> e ，ROI中的时间零样本或杀死的控制比率）。

是添加的底物中的同位素比。这可以通过IRMS获得，或者如果使用购买的基材，可以从制造商获得。

净固定可以外推，以使用生物膜上的生物体积测量来计算每个生物膜吸收的平均净微克C或N。

可以使用文献中的生物体积 - 碳转化因子来估计C含量。细菌的13℃/μm3，对于丝状重氮营养蓝细菌为1.8×10 -6 -13℃/μm3 /（以上）（ Bratbak，1985; Goebel ，，2008），然后用于计算平均μgC在生物膜中

N含量可以基于通过与IRMS分析的生物量的元素分析确定的C/N比率，以及海洋细菌的文献（蓝藻的C/N为4.0，异养菌为4.4），（Fukuda e

将生物膜中蓝细菌或异养生物量中的平均μgC或N乘以该生物体的平均净固定率。

如果检查具有多于一个稳定同位素标签的底物（ i 。 e ，¹³ C以及< sup> 15 N），可以计算相对使用效率（Mayali ，2013），以及使用 t -test与理论平均值1.0相比的平均使用效率，以测试元素偏好（表1）。

使用以下等式计算C/N相对使用效率：[F c C x N（C：N）b]/[FNnet x（C：N）其中（C：N）b 是生物量的C/N比，（C：N）是C/N比，底物，其可以基于文献估计或通过元素分析确定。

表1.代表性的NanoSIMS ROI提取数据和分析

投资回报率 ^a
^{的 12} 的 C <子> 的 2 ^b
^{的 1 第3} 的 C >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> ^b ^{的 1 的 4} 的Ñ >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> ^b
^{的 1 的 5} 的Ñ >>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>>> ^b
^{的 1 第3} 的 C 的/ ^{的 1 的 2} C ^b
^{的 1 的 5} 的Ñ 的/ ^{的 1 的 4} N
^{的 1 的 5} 的Ñ
的的 A 的 P <强>电子 ^c
^{的 1 第3} 的 C
的的 A 的 P <强>电子 ^c
的 ˚F C <子> 名词 ë <强> < 的 ˚F 的 Ñ <子> <强> 名词 <强> 电子的 吨 ^{的 C}
的 C 的 / 的 Ñ <强> rel
的的 û <强> 取值的 e ^c

1
279691.90
8454.86
374425.10
2154.07
0.015
0.006
0.206
0.378
0.540
0.188
1.996

2
210659.20
7840.00
303345.00
2481.86
0.019
0.008
0.445
0.715
1.062
0.471
1.568

3
493302.90
14908.48
657695.20
4458.77
0.015
0.007
0.307
0.377
0.539
0.308
1.219

Ini tial
-
-
-
-
0.011
0.004
-
-
-
-
3.34 ^d

EO M
-
-
-
-
2.09
6.27
-
-
-
-
4.80 ^e

图1D-1F的代表性ROI。
^b从NanoSIMS软件（LIMAGE）提取的计数和比率
根据数据分析部分
中的等式计算的^c ^d（C：N）_b
^e（C：N）

食谱

4％PFA（100 ml）
9.25毫升37％甲醛溶液
将90.75ml 1x磷酸缓冲盐水（用MilliQ H 2 O从10x储备液稀释，pH7.4）
混合在一起并立即使用

无菌10％氯化钠（NaCl）溶液（100ml）
10克NaCl
100ml H 2 O O
混合溶解，在121℃高压灭菌25分钟消毒

改性人造海水基（ASN）介质配方（含硝酸盐）

Che m ical
g/L
最终浓缩

1
NaCl
25
428 mM

2
MgCl 2·6H 2 O
2
9.84 mM

3
KCl
0.5
6.71 mM

4
MgSO 4·H 2 O O
3.5
14.2 mM

5
CaCl 2·2H 2 O O
0.5
3.4 mM

6
NaHCO 3
0.2
2.38 mM

7
Tricine
0.025
0.14 mM

8
KH ₂ PO ₄
0.0494
0.0363 mM

9
NaNO 3
0.0748
1.76 mM

10
FeCl 3
0.001898
0.0117 mM

11
EDTA
0.004355
0.0149 mM

12
3 <3> 3
0.00286
0.0463 mM

13
MnCl 2·4H 2 O
0.00181
9.15μM

14
ZnSO 4·7H 2 O
0.000222
0.772μM

15
NaMoO 4 2H 2 O O
0.00039
1.61μM

16
Co（NO 3 3）2< 2> 2< 2<> 0.0000494
0.17μM

17
氰钴胺素
0.000005
0.00369μM

18
生物素
0.000005
0.0205μM

19
盐酸硫胺素
0.0002
0.593μM

储备a：在蒸馏水中制备1,000倍的8倍储备溶液

库存b：在蒸馏水中准备500倍的9号溶液

库存c：在蒸馏水中准备1000磅10-11的储存液

库存d：在蒸馏水中准备1000倍的12-16储备溶液

库存e：准备1,000磅17-19的储液，过滤灭菌并以1ml等分试样冷冻

加入1-7升1升蒸馏水

加入1ml储备溶液a，c和d和2ml储备溶液b

在121°C高压灭菌20分钟，一次冷却添加库存e

储存溶液a-d可以在4℃下储存长达6个月

致谢

资助由美国能源部基因组科学计划根据合同SCW1039提供。劳伦斯·利弗莫尔国家实验室的工作由能源部合同DE-AC52-07NA27344主持。该协议基于Stuart等人中描述的以前的工作。（2016a和2016b）。

参考

Bratbak，G。（1985）。细菌生物体积和生物量估计。 ）：1488-1493。

Fukuda，R.，Ogawa，H.，Nagata，T.and Koike，II（1998）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9726882"target ="_ blank">直接测定海洋环境中天然细菌组合物的碳氮含量。环境微生物 64（9）：3352-3358。

Ghosal，S.，Fallon，SJ，Leighton，TJ，Wheeler，KE，Kristo，MJ，Hutcheon，ID and Weber，PK（2008）。通过高分辨率二次离子质谱法成像和3D元素表征完整的细菌孢子。化学 80（15）：5986-5992。

Goebel，NL，Edwards，CA，Carter，BJ，Achilles，KM and Zehr，JP（2008）。在亚热带北太平洋（1）观察到的三种不同大小的重氮营养蓝细菌的生长和碳含量 Phycol < em> 44（5）：1212-1220。

Jiao，Y.，Cody，GD，Harding，AK，Wilmes，P.，Schrenk，M.，Wheeler，KE，Banfield，JF and Thelen，MP（2010）。来自嗜酸性微生物生物膜的细胞外聚合物质的表征 > pl Environ Microbiol 76（9）：2916-2922。

Lechene，C.，Hillion，F.，McMahon，G.，Benson，D.，Kleinfeld，AM，Kampf，JP，Distel，D.，Luyten，Y.，Bonventre，J.，Hentschel，D.，Park， KM，Ito，S.，Schwartz，GB，Slodzian，G（2006）。< a class ="ke-insertfile"href ="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17010211" target ="_ blank">使用稳定同位素质谱法对哺乳动物和细菌细胞进行高分辨率定量成像生物 5:20。

Mayali，X.，Weber，PK，Pett-Ridge，J.（2013）。河口社区氨基酸的特异性C/N相对使用效率。 /em> 83：402-412。

Pett-Ridge，J.和Weber，PK（2012）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22639220"target ="_ blank "> NanoSIP：用于微生物生物学的NanoSIMS应用程序。 -408。

Polerecky，L.，Adam，B.，Milucka，J.，Musat，N.，Vagner，T.and Kuypers，MM（2012）。 Look @ NanoSIMS - 用于分析环境微生物学中nanoSIMS数据的工具。 Envir em> 微生物 14（4）：1009-1023。

Popa，R.，Weber，PK，Pett-Ridge，J.，Finzi，JA，Fallon，SJ，Hutcheon，ID，Nealson，KH和Capone，DG（2007）。< a class ="ke-insertfile" href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18043646"target ="_ blank"> > abaena vibrarioides 。我 1（4）：354-360。

Stuart，RK，Mayali，X.，Boaro，AA，Zemla，A.，Everroad，RC，Nilson，D.，Weber，PK，Lipton，M.，Bebout，BM，Pett-Ridge，J。和Thelen，MP （2016a）。细胞外有机碳的光照形状利用和蓝色细菌生物膜中的N. 7（3）。

Stuart，RK，Mayali，X.，Lee，JZ，Craig Everroad，R.，Hwang，M.，Bebout，BM，Weber，PK，Pett-Ridge，J.and Thelen，MP（2016b）。 class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26495994"target ="_ blank">微生物垫胞外有机碳的蓝细菌再利用。 > ISM E J 10（5）：1240-1251。

Woebken，D.，Burow，LC，Prufert-Bebout，L.，Bebout，BM，Hoehler，TM，Pett-Ridge，J.，Spormann，AM，Weber，PK和Singer，SW（2012） class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22237543"target ="_ blank">使用NanoSIMS在沿海微生物垫中鉴定新型蓝细菌群作为活性重氮营养素分析。 J 6（7）：1427-1439。