材料和试剂

90 x 15毫米培养皿（任何品牌都可以满足）
塑料薄膜（聚氨酯材料，任何百货公司）
1,000μl移液器吸头（Corning，Axygen ^®，目录号：TF-1000-R-S）
200μl移液器吸头（Corning，Axygen ^®，目录号：TF-200-R-S）
10μl移液器吸头（Corning，Axygen ^®，目录号：TF-300-R-S）
聚酯滤布切成8×8厘米的方形（任何织物店）
通过我们的实验室和全基因组测序分离出青霉菌T01 ：（Li等人，2015）
新鲜收获的红富士苹果
甘油（AMRESCO，目录号：M152）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：T2700）
次氯酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：239305）
无菌蒸馏水
土豆
葡萄糖（Macklin，目录号：D823520）
琼脂（HUAAOBIO，目录号：HA0552）
2％次氯酸钠溶液（见配方）
PDA媒体（见食谱）

设备

洁净台（北京东联哈尔仪器制造，型号：SCB-1520）
无菌指甲（直径约3毫米，手动抛光）
恒温培养箱（TAICANG，型号：THZ-C）
血细胞计数器（QIUJING，目录号：XB-K-25）
Vortexer（选择BioProducts，型号：SBS100-2）
100μl-1,000μl移液器（Eppendorf，目录号：3120000267）
10μl-1,100μl移液器（Eppendorf，目录号：3120000240）
0.5μl-1,0μl移液管（Eppendorf，目录号：3120000224）
光学显微镜（重庆OPTEC仪器，型号：B203LED）
40 x 30 x 10厘米塑料篮（任何品牌都可以满足）
手持喷雾器（任何品牌都可以满足）
40 x 40 x 30厘米集装箱（任何品牌都可以满足）
Hygrothermograph（Fisher Scientific，目录号：11-661-20）

软件

SPSS版本13.0

程序

水果消毒
1. 作为实验材料，使用具有均匀尺寸和颜色，没有身体伤害的季节性苹果果实
2. 将水果在2％次氯酸钠溶液的容器中进行表面消毒2分钟，用去离子水冲洗3次，并在干净的工作台中空气干燥。
3. 在接种病原体之前，每个苹果的赤道上用无菌指甲面对面的两个伤口（3×3mm）（图1A）。
  
  图1.苹果果实的接种。膨胀。 A.无菌指甲水果的伤口B.接种后果实的贮藏条件
病原菌接种物准备
1. 将5微升孢子悬浮液（16×甘油中的5×10 6/ml，储存于-80℃）。将膨胀接种在PDA板上，并在25℃下在黑暗中培养2周。
2. 用0.05％吐温20收获分生孢子，并通过四层无菌聚酯滤布过滤。使用光学显微镜用血细胞计数器计数分生孢子，并用0.05％吐温20稀释至浓度为1×10 5 /分钟/分钟。
接种
1. 苹果果实的每个伤口部位用5μl孢子悬浮液接种（悬浮液在接种之前通过涡旋混合）用移液管接种。用0.05％吐温20的无菌蒸馏水作为对照
2. 将六个接种的水果放入塑料篮中并用塑料膜密封，用手持式喷雾器将约5ml无菌水喷在塑料膜的内部，以保持高的相对湿度（约95％），并储存在25° C在黑暗中（图1B）
疾病评分
病变直径在接种3天后每天进行测量。记录两个相互垂直方向上的每个病变的两个直径值。两个值的平均值定义为病变的直径（图2）

图2.感染的苹果果实的致病性分析。 A.感染的苹果果实在25℃下接种4天后的症状; B.腐烂苹果果实的疾病评分。

数据分析

然后用统计软件SPSS 13.0版分析来自三个独立实验的数据，每个实验共24个果实（48个伤口）。使用Duncan的多范围测试进行ANOVA测试; 0.05。

代表数据

图3显示了ΔGeneA和ΔGeneB两种基因敲除突变体的致病性测定的代表性数据。膨胀，在苹果果实上。为了比较突变体和WT的毒力差异，将不同的菌株接种到苹果果实的伤口中。在接种后4,5和6天检测到ΔGeneA和WT之间的病变直径没有显着差异（图3A和3B）。删除 GeneB 显着降低了P的毒力。水果的膨胀。在接种后5天可以观察到明显的损伤，其中ΔGeneB的损伤直径明显小于野生型的损伤尺寸（Figuers 3C和3D）。这些结果表明，GeneB 对P的毒力有显着的影响。 expansum 。

图3.PG的ΔGeneA和ΔGeneB的致病性测定。苹果果实上的膨胀 .A和C.感染苹果果实在接种5 d后的症状。 B和D.在25℃下接种后4,5和6天的病变直径的统计学分析。

笔记

使用1-2周龄的培养物确保P的完全致病性。膨胀孢子。
苹果水果必须是新鲜的，没有机械伤口。
感染苹果果实的培养温度必须控制在25°C或稍低于25°C。

食谱

2％次氯酸钠溶液（20升）
将400毫升次氯酸钠加入到40 x 40 x 30厘米的容器中，然后用蒸馏水将体积提高到20升。
PDA媒体（1升）
200克土豆
20克右旋糖
15克琼脂
将200克切片的土豆在1升蒸馏水中煮沸30分钟，然后通过干酪布滗析肉汤，并在肉汤中加入20克葡萄糖和15克琼脂粉末。加入蒸馏水组成1升，培养基通过121℃高压灭菌20分钟灭菌

致谢

该协议由Li等人改编。（2015）和张等人。（2014）。这项工作得到了中国科技部的支持（授权号码2016YFD0400902）。

参考

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Li，B.，Zong，Y.，Du，Z.，Chen，Y.，Zhang，Z.，Qin，G.，Zhao，W。和Tian，S。（2015）。基因组表征揭示了青霉属物种中patulin生物合成和致病性的见解。Mol Plant Microbe Interact 28（6）：635-647。

Liu，J.，Sui，Y.，Wisniewski，M.，Droby，S.，Tian，S.，Norelli，J.and Hershkovitz，V。（2012）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925521411002535"target ="_ blank">热处理对桃果实抑制的影响和诱导桃果实的抗病性 Postharvest Biol Tec 65：61-68。

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Zhang，Z.，Qin，G.，Li，B.and Tian，S。（2014）。在Botrytis cinerea 中敲除 bcsas1 影响细胞外蛋白质的增长，发育和分泌，从而降低毒力。 Mol Plant Microbe Interact 27（6）：590-600。