材料和试剂

移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：9400327,9401255,9401410）
35或60 mm细胞培养皿（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：153066或150288）}
12ml螺旋盖玻璃管（Kimble Chase Life Science and Research Products，目录号：45066A-16100）
巴斯德移液器（BRAND，目录号：747720）
12 x 32毫米带瓶盖的螺旋瓶（WATERS，目录号：186002640）
11.5×75mm试管（VWR，目录号：ZZ130296772）
电池刮刀和升降器（VWR，目录号：734-2603和734-2602）
HeLa细胞或其他培养的哺乳动物细胞
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Merck Millipore，目录号：524650）
甲醇（VWR，目录号：83638.320）
质谱分析所需的内标：

Di-20：1-磷脂酰胆碱（PC）（Avanti Polar Lipids，目录号：850396）
Di-20：1-磷脂酰乙醇胺（PE;由对应PC内部合成）（Käkelä等人，2003）
Di-20：1-磷脂酰丝氨酸（PS;由相应的PC合成）（Käkelä等人，2003）
Di-16：O-磷脂酰肌醇（PI）（Avanti Polar Lipids，目录号：850141）

氯仿（Merck Millipore，目录号：102445）
乙腈，LC-MS级（Fisher Scientific，目录号：A/0638/17X）
异丙醇，Optima ^{TM/LC/MS级（Fisher Scientific，目录号：A461-212）}
甲酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：70221）
氨溶液25％Suprapur（Merck Millipore，目录号：105428）
乙酸，冰川（Fisher Scientific，目录号：10171460）
氘标记的胆碱（D 9-胆碱氯化物）（C/D/N同位素，目录号：D-2142）
氘标记的乙醇胺（D 4 - 乙醇胺）（Cambridge Isotope Laboratories，目录号：DLM-552-1）
氘标记的丝氨酸（D 3 -L-丝氨酸）（Cambridge Isotope Laboratories，目录号：DLM-1073-1）
氘标记的肌醇（D 6 - 肌醇 - 肌醇）（C/D/N同位素，目录号：D-3019）
羟胺（Sigma-Aldrich，目录号：55460）
Dulbecco改良的Eagle培养基高葡萄糖（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：41965039）或适合感兴趣细胞系的其他培养基
注意：我们在含有10％胎牛血清和100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的DMEM中生长HeLa细胞。}
氯化胆碱（Sigma-Aldrich，目录号：C1879）
乙醇胺（Merck Millipore，目录号：800849）
肌醇 - 肌醇（Sigma-Aldrich，目录号：I5125）
L-丝氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：S4500）
胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F7524）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
Milli-Q H 2 O（Elga Stat Maxima反渗透净水器）
氮气（Aga，工业气体，99.95％）
标签介质（参见食谱）
追逐媒介（见食谱）

设备

移液器（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：4600170,46000040和4600250）
微量注射器（Hamilton，型号：705N，目录号：80565）
涡街搅拌机（VWR，目录号：444-1372）
离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Heraeus ^TM Megafuge ^TM 1.0）
通风柜
带有氮气蒸发的样品浓缩器（Cole-Parmer，Techne，目录号：FSC400D）
质谱仪或服务提供商分析样品
注意：我们使用Quattro Micro和Quattro Premier三重四极杆质谱仪（WATERS，型号：Quattro Premier质谱仪）
Acquire FTN超高效液相色谱仪（WATERS，型号：ACQUITY UPLC H-Class系统）
1.0 x 150 mm Acquity BEH C18色谱柱（WATERS，目录号：186002347）

软件

MassLynx 4.1和QuanLynx软件（WATERS）
LIMSA软件（Haimi等人，2009）

程序

新合成磷脂的代谢标记
为了确定将氘标记的头基团掺入甘油磷脂的时间过程，您需要几个具有贴壁细胞的培养皿。在与标记的头基前体孵育的0,1,2,4,8,12,24和48小时之后，适当时候例如在适当时间收集来自培养皿的细胞。

生长细胞，直到菜肴融入70-80％。粘附细胞系如HeLa，CHO或BHK-21细胞是适合的
用1ml PBS洗涤细胞一次以除去分离的细胞
每35或60毫米盘子加入1或1.5毫升标记培养基（参见食谱），孵育细胞长达48小时。
在适当的时间从盘中收集细胞。用1ml PBS洗涤3次，然后用2ml冰冷的H 2 O 2刮去细胞，并将细胞移至12ml螺旋盖管中。
短暂地涡旋，用移液管悬挂细胞并收集，例如，如果需要，将50μl等份的细胞悬液用于蛋白质测定。
向剩余的悬浮液中加入3ml甲醇并涡旋
储存于-20°C，直至准备好提取脂质。

脉冲追逐实验
为了确定甘油磷脂的翻转，首先用标记的前体孵育细胞长达24小时，用PBS洗涤细胞，然后将其在含有相应的未标记头基团前体的培养基中孵育。在这个追逐期间，从例如，0,1,2,4,8和24小时的培养皿中收集细胞以确定转换率。

按步骤1a-1c所述标记新合成的磷脂4-24 h
用细胞培养基洗涤三次以除去标记的前体。
向每个培养皿中加入1或1.5ml的追踪培养基，并孵育长达48小时。
首先以1-2小时的间隔收集细胞（参见步骤1d-1g），然后以更长的间隔收集细胞。

脂质的提取

加入内部GPL标准鸡尾酒，内部GPL标准包括二十：1-PC，di 20：1-PE，di 20：1-PS和di 16：0-PI（10,5,2,2nmol/100nmol甘油磷脂），进行质谱分析，然后提取脂质（见注释）。我们使用Folch脂质提取方法（Folch等人，1957），除了没有添加盐。
加入6毫升氯仿，加入盖子，将管子反复翻转，再次快速回收40-50次
以3,000 x g离心10分钟。
用玻璃巴斯德移液器将下相转移到新的12毫升螺旋盖管中，加入4毫升含有氯仿/甲醇/H 2 O（3:48:47，v/v）并如步骤3b所述混合。
离心机如步骤3c，并收集较低的相位。
加入0.5ml甲醇，涡旋，并在氮气流下使用温和加热（<40℃）蒸发至干。
将20-40μl甲醇/氯仿（4:1，v/v）中的提取的脂质重建在12×32mm螺旋瓶中用于LC-MS分析，或在250μl甲醇/氯仿（2:1，v/v）在11.5 x 75 mm试管中进行MS/MS分析，并在-20°C储存

质谱分析
注意：可以使用LC-MS或MS/MS使用直接样品输注进行，如下所示。

液相色谱 - 质谱
使用由Acquire FTN超高效液相色谱仪（WATERS）组成的LC-MS系统分析GPL分子种类，该仪器配备有连接到Quattro Micro或Premier三联体的1.0×150mm Acquity BEH C 18 - 反相质谱仪（WATERS）。将柱用异丙醇/乙腈（90:10）的梯度洗脱到各自含有10mM甲酸铵和1％NH 4的乙腈/H 2 O（60:40）（Kainu等人，2013）。流速为0.13ml/min。使用如（Kainu等人，2013）所述的多反应监测（MRM）检测个体脂质物质。质谱仪以正离子模式运行，PC，PE，PS和PI的前体离子为[M + H] + sup。未标记物种的产物离子是184（PC），141（PE），185（PS）和260（PI），氘标记物种m/z分别为193,145,188和266。典型的m/z转换在表1中列出。水溶性GPL代谢物也用LC-MS分析，如（Hermansson等人，2016）所述。使用MassLynx 4.1软件（WATERS）收集数据。
使用直接样品输注的MS/MS分析该方法不需要LC仪器，因为当样品用玻璃微量注射器以10-20μl/分钟的速率输入质谱仪时，可以基于其头部基团特异性片段选择性地检测粗脂质提取物中的不同GPL，分钟。通过分别扫描m/z +184和-241的前体来选择性地检测未标记的PC和PI物质，而通过监测中性损失（NL）检测未标记的PE和PS物种，分别为141或87。通过扫描193（PC）或247（PI）的前体或145（PE）或90（PS）的中性损失来选择性地检测标记的PC，PI或PE和PS物种。

表1. LC-MS分析中用于选择性GPL分子种类的MRM前体和产物离子

数据分析

分析方法取决于用于数据采集的方法。在LC-MS方法的情况下，使用QuanLynx软件（WATERS）定量标记和未标记的脂质（及其代谢物）。
当使用直接输注的MS/MS方法时，将头组特异性MS/MS光谱数据复制到Excel，然后运行LIMSA加载项。这提供了基于所包含的内部标准的单个GPL种类的浓度（Haimi等人，2009）。当需要时，绘制GPL浓度对时间，并通过使用Origin软件（OriginLab，Northampton，MA）进行曲线拟合获得更换率。
典型结果
图1显示了加入到HeLa细胞生长培养基中的D 9个 - 胆碱的一个代表性PC物种的标记。

图1. HeLa细胞在含有D 9个 - 胆碱的培养基中培养1,8或24小时，提取细胞脂质，通过LC-PCR分析标记和未标记的PC物质，使用MRM检测的MS。未标记的36：2-PC（ m/z 786.5）以紫色显示，并且相应的标记PC种类（em/m/z 795.5 ）绿色。

笔记

许多GPL标准可从例如获得，Avanti Polar Lipids（Alabaster，AL）。
对于最准确的定量，应使用要分析的每种脂质物种的重同位素标记的内标（Krautbauer等，2016; Wang等人，2016年）），但由于缺乏这样的商业标准，很少这样做。然而，在本方法中，标记是根据标记的GPL物种的强度相对于相应的未标记的GPL种类的强度确定的，因此不需要内部标准。

食谱

贴标介质

用乙酸将D 4 - 乙醇胺溶液的pH调节至7.0，并与H 2 O 2中的其他氘标记前体和羟胺混合，得到前体原液（通常为100x）。储存于-20°C
注意：乙醇胺的pH高，因此需要用乙酸中和，以避免标记和追踪培养基碱化。
通过在生长培养基中加入储备溶液来制备标记培养基以获得以下浓度：D 9 - 胆碱100μg/ml，D 4+乙醇胺100μg/ml， D 3 -L-丝氨酸300μg/ml，D 6 - 肌醇100μg/ml，和1mM羟胺 > 注意：羟胺是PS脱羧酶的抑制剂，其防止磷脂酰丝氨酸（PS）在细胞中磷脂酰乙醇胺（PE）的脱羧。羟胺的存在是避免由于通过CDP-乙醇胺途径形成的标记的PE物质与通过标记的PS的脱羧形成的PE物质的峰重叠而引起的MS峰所必需的。然而，如果由PS经由脱羧形成的PE物质是令人感兴趣的，则必须从介质中省略羟胺以及标记的乙醇胺以避免这种重叠。

追逐媒介
含有未标记胆碱（500μg/ml），乙醇胺（500μg/ml），L-丝氨酸（1,000μg/ml），肌醇（500μg/ml）和1mM羟胺的DMEM为储存于4°C并在同一天使用

致谢

该协议用于以下出版物：Kainu等人，2013; Hermansson等人，2016; Kainu等人，2008年。这项研究得到了芬兰学院和Sigrid Juselius基金会的资助。

参考

de Kroon，AI（2007）。磷脂酰胆碱的代谢和其对酿酒酵母中脂质酰基链组成的影响。 Biochim Biophys Acta 1771（3）：343-352。
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Kainu，V.，Hermansson，M.，Hanninen，S.，Hokynar，K.和Somerharju，P。（2013）。从线粒体进入磷脂酰丝氨酸至磷脂酰乙醇胺分子物质的出口。生物化学Biophys Acta 1831（2）：429- 437.
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