材料和试剂

60 x 15 mm培养皿（Excel Scientific，目录号：D-901）
移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：0094300120）
真空过滤器（Corning，目录号：430320）
2，20规格绝缘铜线，切割至8厘米段（德尔市，目录号：1120101）
塑料管，切成9毫米段（Emurdock，目录号：AAQ04127）
注意：本产品已停产。
2 x鳄鱼夹线（United Scientific Supplies，目录号：WAG024-PK/6）
℃。线虫野生型菌株N2（从Caenorhabditis获得遗传学中心）
LB肉汤粉（Fisher Scientific，目录号：BP1426-500）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
琼脂（Sigma-Aldrich，目录号：A7002）
蛋白胨（Fisher Scientific，目录号：BP1420）
氯化钙溶液（CaCl 2）（Sigma-Aldrich，目录号：21115）
硫酸镁溶液（MgSO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：M3409）
胆固醇（Sigma-Aldrich，目录编号：C8667）
乙醇（Fisher Scientific，目录号：04-355-226）
磷酸氢二钾（K 2/2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P3786）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：P5655）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：795410）
LB肉汤（见食谱）
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板（参见食谱）
KP缓冲（见配方）
电子。大肠杆菌菌株OP50（参见食谱）
M9解决方案（请参阅食谱）

设备

2升烧瓶

移液器

搅拌棒

解剖立体显微镜（Tritech Research，型号：SMT1）

解剖立体镜（AmScope，型号：SM-1TSX）

定时器输出刺激器（Grass Instruments，型号：S44）

刺激器（Grass Instruments，型号：SD9）

CCD彩色显微镜相机（日立，型号：KP-D20BU）

电视监视器（RCA，型号：19LA30RQ）

HDD和DVD刻录机（Magnavox，目录号：MDR535H/F7）

DVD可刻录光盘（Verbatim，目录号：95032）

数字示波器（OWON Technology，目录号：PDS5022T）

乙醇灯（Carolina，目录号：706604）

水浴（50°C）（Corning，型号：Corning ^® LSE ^{TM数字水浴，目录号：6783）}

孵化器（37°C）（Thelco，型号：4）

培养箱（20℃）（Cuisinart，目录号：CWC 1200DZ）

定时器（VWR，目录号：62344-641）

公制尺（Fisher Scientific，目录号：09-016）

红外温度枪（J-1贸易批发，Nubee，目录号：NUB8380）

软件

开源图像处理程序，我们使用VLC媒体播放器（版本2.2.4）

SigmaPlot 11.0（Systat Software，Inc.，San Jose，CA，USA）

程序

根据相机说明将显微镜相机设置到电视机和数字录像机（图1和2A）。

实验装置包括立体镜（A），示波器（B），定时器输出激励器（S44）（C），刺激器（SD9）（D）以及记录设备（E）。

图2.实验设置和分析的简化示意图A.立体镜（中心），记录设备（左）和刺激器（右）表示基本实验设置的简化示意图。为了控制持续时间，我们的设置包括一个额外的刺激器（S44）;然而，时间可以通过许多不同的方法来控制。 B.用铜线插入任一端的实验管的近似示意图; C.该示意图表示震动前蠕虫的正常正弦体位置（箭头）。在休克期间和之后，蠕虫通常会出现抽搐和麻痹，然后通常恢复正常的正弦运动。这个数字改编自Risley等人，2016年。

通过带有香蕉插头分离器的电缆将S44刺激器上的输出连接到SD9刺激器上的地面和模拟香蕉插头输入。这里的目标是将S44连接到SD9刺激器，以便S44可用于调整持续时间。
注意：确保香蕉插头的极性一致。
将S44设置为至少5 V和所需的刺激持续时间;我们使用3秒。
将其中一个鳄鱼夹夹在SD9的正（+）输出上，另一根到另外的（ - ）输出。这些鳄鱼夹线将SD9刺激器连接到实验管（图3和图2B）

图3.实验管的特写镜像。将管连接到与刺激器连接的绝缘铜线的两端。铜线之间的距离应为10毫米。
接下来将每根铜线夹到每个鳄鱼夹的开口端。当实验准备开始时，每根铜线的开口端将被直接插入实验管中。根据相机说明将显微镜相机设置到电视机（图1和图2A）。
注意：一直设置实验管以获得一致性是非常重要的。
1天龄的成年人秀丽隐杆线虫用于实验。在实验前24小时，每基因型大约30个L4级蠕虫转移到用OP50E接种的新鲜NGM板上。大肠杆菌。将蠕虫置于20℃培养箱中过夜;并将在约18小时内成熟为1日龄的成年人。在第二天的实验中，将蜗杆放在室温（23℃）的实验台上
通常，药物溶液在实验的早晨制备。根据实验试验的数量，将药物直接溶解到总量为3-5ml的M9溶液瓶中。此时也准备了假手术控制。所制备的试剂可以在4℃下或基于药物的规格储存，用于连续进行的实验。
注意：水溶性药物直接溶解到M9（Risley等，2016）;然而，在Risley等人中进行DMSO浓度曲线。（2016），据报道，DMSO浓度高达0.5％，对电击后的野生型运动恢复无明显影响。
接下来，将空白DVD + R加载到HDD/DVD刻录机中，然后打开电视屏幕。此外，请使用示波器验证定时器输出激励器和激励器上的设置是否正确。我们通常将电击参数设置为47 V，3秒持续时间。该电压根据电压 - 响应曲线选择。野生型蠕虫恢复的最大电压约为60 V，平均恢复时间为85秒。选择47 V作为蠕虫恢复大约恢复最大限制时间的一半（图4）。
注意：定时器输出激励器（S44）仅用作SD9刺激器的触发器，SD9刺激器向蠕虫发送电流。持续时间（通常为3秒）在S44上设置，并用作调节持续时间的触发器。还有许多其他方式来控制持续时间，包括通过计算机或Arduino使用数字触发。

图4.电压响应曲线表明野生型蠕虫的运动恢复时间。野生型蠕虫在电压≥70V时没有恢复。恢复的最大测试极限为60 V，其中蠕虫恢复约80秒。 47 V是恢复时间为最大限制的50％的电压。这个数字改编自Risley等人，2016年。
加载约20μl对照溶液或药物溶液。紧随其后，使用铂金挑选装入6-8个蠕虫管，并设置一个计时器30分钟。定时器超时前30秒，将灯管轻轻放置在显微镜/摄像机设置下，灯座开启，并将每根铜线插入管的两端;电线应相隔10 mm（图3和2B）。验证铜线之间的距离是否精确（标尺就足够了），并启动电击。让实验记录10分钟。记录10分钟后，管子及其内容物被丢弃。
注意：通常，每10分钟加载一个管。每个管被震动并记录10分钟，然后丢弃，并立即准备另一个管。此外，应将铂选择转移到管的OP50应尽量减少，因为它可能会阻碍蠕虫的观察。

数据分析

使用视频播放器手动分析分析。每个蠕虫在每个管中分别得分。图5中可以看到原始视频文件的示例屏幕截图和图2C中的示意图。记录休克时间（由气泡的外观所示）记录在笔记本中，并记录每个蠕虫的随后恢复时间。

图5.记录的原始数据的截图示例。图像是实验的原始数据视频文件的屏幕截图。管中间有五个蠕虫。管子由两端的铜线堵塞。这是由研究人员分析的视频文件的示例。
恢复被定义为一种蠕虫恢复其在正弦运动中移动的能力，类似于在休克之前展示的运动。只有头部或尾部的部分恢复不被认为是恢复。（视频1）
每个蠕虫的恢复时间被认为是n = 1，实验管的总数为N = 1。对于所有实验，全数据集被认为是n≥10且N≥6。
数据在SigmaPlot中使用单向ANOVA分析，随后进行事后多重比较测试或学生测试;然而，适当的统计分析应由研究人员确定。数据通常由条形图±SEM表示。数据条形图的一个例子可以在图4的电压 - 响应曲线中看到。

笔记

由于在刺激期间的电解，气泡将形成在管的边缘上。被气泡覆盖的蠕虫被排除在分析之外。我们使用红外温度枪记录3秒以上的温度波动。温度波动是急剧和极小的，1±0.5℃，但应记录温度以确保升高的温度不会增加电击的影响。如果冲击时间超过3秒，应注意温度不会大幅度增加，这可能会导致结果的混乱。
分析过程中没有考虑正弦运动的速度
没有恢复的蠕虫被排除在分析之外。

食谱

LB肉汤
将25g LB肉汤粉末和1L dH 2 O加入到2L烧瓶中高压灭菌30分钟
线虫生长培养基（NGM）琼脂平板

将3g NaCl，17g琼脂，2.5g蛋白胨和975ml dH 2 O加入到2L烧瓶中。
高压灭菌30分钟
在水浴中冷却至50°C
加入1ml 1M CaCl 2，1ml 1M MgSO 4，溶于1ml 95％乙醇中的5mg胆固醇，25ml KP缓冲液加到琼脂溶液中，混合每次添加之后，
吸取10毫升到每个60 x 15毫米培养皿
盖住并在4°C下存放
当需要时，种子板用50μlOP50E。大肠杆菌，并在37℃下孵育过夜

KP缓冲区
将2.46g KH 2 PO 4和1.205g K 2 HPO 4加入到25ml二氯甲烷中， 2 O与搅拌棒
调节pH至6.0和真空过滤器
OP50 E。大肠杆菌
从LB肉汤中的板材上悬挂1个OP50大肠杆菌菌落在37℃下孵育过夜，盖子松动地放在
上储存于4°C
M9解决方案
加入3g KH 2 PO 4，6g Na 2 HPO 4，5g NaCl，1ml 1将M MgSO 4向2L烧瓶中加入并加入二氢氯化铵至1L的二氯甲烷/ 高压灭菌15分钟，并在室温下储存

致谢

我们已经在（Risley等人，2016）发布了这个协议。一些菌株由CGC提供，由国家卫生研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。

参考

Lee，J. and Wu，CF（2002）。在果蝇中的电惊厥发作行为：分析敏感突变体中定型动作模式的生理谱系。 Neurosci 22（24）：11065-11079 。
Risley，MG，Kelly，SP，Jia，K.，Grill，B.and Dawson-Scully，K.（2016）。调制C中的行为。 elegans 使用电击和抗癫痫药物。 PLoS One 11（9）：e0163786。
Vashlishan，AB，Madison，JM，Dybbs，M.，Bai，J.，Sieburth，D.，Ch'ng，Q.，Tavazoie，M.and Kaplan，JM（2008）。 RNAi屏幕识别调节GABA突触的基因。神经元< em> 58（3）：346-361。
Williams，SN，Locke，CJ，Braden，AL，Caldwell，KA和Caldwell，GA（2004）。在秀丽隐杆线虫中的神经递质信号的细胞骨架控制中与LIS-1相关的癫痫样抽搐 Hum Mol Genet 13（18）：2043-2059。