材料和试剂

转染293T细胞和野生型（wt）AAV生产
1. 100毫米的菜肴（康宁，目录号：430293）
2. 293T细胞（ATCC，目录号：CRL-11268）
3. pAV2质粒（Laughlin等人，1983，ATCC获得，目录号：37216）
4. 线性聚乙烯亚胺（PEI），分子量25,000，1mg/ml和pH7.0（Polysciences，目录号：23966-1）
5. wt的腺病毒血清型5（Graham和Prevec，1991，可得自ATCC，目录号：VR-1516）
6. Dulbecco改良Eagle's培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：31966021）
7. 胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10270106）
8. 1x Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：14190094）}
提取低分子量DNA
1. 15ml锥形管（Corning，目录号：430791）
2. 1.5 ml管子
3. Hirt裂解缓冲液（参见食谱）
4. 蛋白酶K溶液（20mg/ml）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：25530049）}
5. 氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
6. 苯酚 - 氯仿 - 异戊醇25:24:1（Sigma-Aldrich，目录号：77617）
7. 乙酸钠（CH 3 COONa）（Sigma-Aldrich，目录号：71183）
8. 2-丙醇（EMD Millipore，目录号：109634）
9. 乙醇（EMD Millipore，目录号：100983）
10. ddH 2 O（Thermo Fisher Scientific，Ambion ^TM，目录号：AM9937）
11. RNaseA（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：EN0531）
使用 Rep 和 Amp 探针的Southern印迹分析
1. Whatman ^TM论文（GE Healthcare，目录号：3030-917）
2. Amersham Hybond-N +膜（GE Healthcare，目录号：RPN203B）
3. 杂交管（Chemglass Life Sciences，目录号：CG-1140-05）
4. 快速旋转柱用于放射性标记的DNA纯化（Roche Diagnostics，目录号：11273973001）
5. I（New England Biolabs，目录号：R0176S）
6. UltraPure ^{TM琼脂糖（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：16500500）}}
7. TAE（Tris-acetate-EDTA）缓冲液（参见食谱）
8. 1 kb DNA ladder（New England Biolabs，目录号：N3232）
9. 20x盐水柠檬酸钠（SSC）溶液（参见食谱）
10. 变性溶液（见配方）
11. 中和解（见配方）
12. 探针引物
  fw：AACTGGACCAATGAGAACTTTCC; rv：AAAAAGTCTTTGACTTCCTGCTT
13. 探针引物
  fw：AATCAGTGAGGCACCTATCTCAGC; rv：AACTCGGTCGCCGCATACACTATT
14. Go Taq ^®无色主混合PCR试剂盒（Promega，目录号：M7132）
15. QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN，目录号：28704）
16. dCTPs，[α³² P] -6,000Ci/mmol 20mCi/ml，250μCi（PerkinElmer，目录号：BLU013Z250UC）
17. Prime-It RmT随机引物标签试剂盒（Agilent Technologies，目录号：300392）
18. 尼龙洗涤液（参见食谱）

设备

移液器
CO 2亚型培养箱（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：HeraCell 240）}
血细胞计数器
冷藏台式微量离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Heraeus ^TM Fresco ^TM 17）}
冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Heraeus ^TM Multifuge ^TM X3R）}
微生物安全柜（医用航空技术，型号：BioMAT ² II级）
NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：NanoDrop 1000或NanoDrop 2000）}
凝胶电泳系统（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Owl ^TM A1）}
平台振动筛（Heidolph Instruments，型号：Polymax 1040）
玻璃板
玻璃托盘
紫外线交联剂（UVP，型号：CL-1000）
杂交炉（UVP，型号：HB-1000）
Perspex屏幕（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Nalgene ^{TM压克力台式Beta辐射防护罩，目录号：67002418）}}
台风分子动力学荧光/荧光成像仪（GE Healthcare，型号：Trio Variable Mode Imager）
PCR热循环仪（Eppendorf，型号：Mastercycler ）
热块（Cole-Parmer，Stuart，目录号：SBH200DC）
存储荧光屏（GE Healthcare，目录号：28-9564-75）
曝光盒（GE Healthcare，目录号：63-0035-44）

软件

ImageQuant分析软件（GE Healthcare）

程序

转染293T细胞和AAV生产
1. 在10ml培养基（DMEM + 10％FBS）的10cm培养皿中种子4.3×10 6个细胞用于转染第二天。包括额外的板以确定腺病毒感染时的细胞数。细胞在37℃和5％CO 2维持24小时。
2. 在500μl的DMEM（没有添加血清，SF DMEM）中稀释17.5μg的pAV2质粒。
3. 在500μlSF DMEM中稀释94μlPEI，轻轻混合。转染试剂应在室温（RT）下混合。在室温下孵育5分钟。
4. 结合PEI和DNA，并通过移液轻轻混合。在室温下孵育20分钟
5. 将混合物加入细胞生长的培养基中。仔细吸管以避免分离细胞。
6. 转染后4小时，在额外的板中测定细胞数（例如使用血细胞计数器）
7. 使用5 pfu /细胞的腺病毒感染细胞。包括没有腺病毒的病毒作为AAV复制的阴性对照。
8. 转染后40〜50 h预计会产生细胞致病作用。细胞将向上并最终分离（图1）注意：转染后40至50 h完全支持AAV复制和引起细胞致病作用所需的腺病毒量可能会因使用的细胞系的健康状况及其通过次数而异。这可能需要在开始此协议之前进行优化：用增加量的腺病毒感染细胞并监测细胞致病作用的出现（图1）。
  
  图1. AAV和腺病毒诱导的细胞致病作用。左图：转染后24小时细胞粘附并形成单层。右图：转染后55 h细胞致病性明显;细胞已经四舍五入，从板上抬起。刻度棒=50μm。
提取低分子量
1. 将细胞和上清液收集在15ml锥形管中。细胞应松散粘附，并可通过移液分离。用2ml 1x DPBS洗板，加入15ml管中
2. 在室温下以500×g离心5分钟。
3. 弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于1ml DPBS中。将250μl转移到新的1.5 ml管中。可以收集剩余的细胞用于额外的分析，例如基因和蛋白质表达。
4. 在室温下在室温下以500×g离心5分钟，并倒出上清液。
5. 加入500μlHirt裂解缓冲液，通过轻拂或反转管混合。
  注意：裂解物将非常粘稠，通过移液混合会产生气泡。
6. 在室温下孵育10分钟。
7. 加入1.25μl蛋白酶K（50μg/ml终浓度），37℃孵育1 h
8. 加入120μl5 M NaCl（1M终浓度）。轻轻地/轻轻地混合管。
9. 在4℃下孵育过夜。该步骤沉淀出高分子量（染色体）DNA
10. 在4°C的冷藏台式离心机中以最大速度离心1小时（17,000 x g）离心机。
11. 小心地将上清液（约500μl）转移到新的1.5 ml管中。
  注意：如果上清液不能从粘稠颗粒充分分离，可能需要较长的离心。
12. 在通风橱下，加入1体积（500μl）的苯酚/氯仿/异戊醇，并通过倒转管混合直到均匀。
13. 在4℃下以17,000 x g离心10分钟。
14. 小心地将上层转移到新的1.5 ml管中（约450μl）
15. 加入50μl3M乙酸钠（0.3M终浓度）并混合
16. 在-20°C孵育过夜。
17. 在4℃下以17,000×g离心20分钟。
18. 仔细取出并弃去上清液，然后用100μl70％乙醇洗涤DNA沉淀
19. 在4℃下以17,000 x g离心10分钟。
20. 去除上清液并空气干燥DNA沉淀。
21. 将沉淀重悬于80μlddH 2 O中。
22. 使用NanoDrop分光光度计测定样品中DNA的浓度。典型的DNA浓度约为750 ng /μl
Southern印迹测定（凝胶转移）
1. 将大约1μg的提取的DNA用DpnI消化，在37℃下2小时。 Dnn特异性地消化甲基化的DNA，例如，在dam ^{+细菌菌株中扩增的DNA。该步骤确保输入质粒DNA被消化，而新重复的AAV DNA不会受到影响。}
2. 将消化的DNA在0.8％琼脂糖凝胶上以1V/cm分离过夜
3. 从电泳槽中取出凝胶，并在平台式搅拌器上以约25 rpm的变性溶液温育30分钟。
4. 在ddH O中冲洗凝胶两次。
5. 在平台式搅拌器上以约25 rpm的速度在中和溶液中孵育凝胶30分钟。
6. 用新鲜的中和溶液代替中和溶液，再振荡30分钟
7. 在ddH <2> O中冲洗，然后继续安装传输设置，如图2所示。
  
  图2.用于Southern印迹的毛细管转移方法的方案支撑板是搁置在含有20x SSC的玻璃托盘的侧面上的玻璃板。纸巾层高约15厘米。使用的重量约为600克。
8. 孵育过夜，通过毛细管法将凝胶中的DNA转移到尼龙膜上（图2）。要在尼龙膜上获得与凝胶上相同的样品取向，请将凝胶倒置。
9. 拆卸设备，小心取出膜。
10. 在2x SSC中冲洗膜，让其风干。
11. 为了将DNA固定在膜上，UV以120,000μJ/cm 2的比例交联膜。
12. 将膜在20毫升0.75倍尼龙清洗液中预先杂交至65℃的杂交管中至少1小时。
1. 使用上述引物对和下面列出的PCR条件，通过PCR对pAV2质粒进行PCR获得用于制备 Rep 和 Amp 特异性探针的模板。 PCR产物用NanoDrop分光光度计进行凝胶纯化和定量。 PCR产物的预期大小是PCR反应的338碱基对，而PCR产物的预期大小是587。使用20至25ng纯化的PCR产物DNA作为DNA模板来制备探针对于 Rep 和 Amp PCR，混合最终体积为25μl：
  
  Go Taq 无色主混音（2x）
  12.5μl
  
  Fw 或 Amp 引用（10μM）
  1μl
  
  Rv 或 Amp 引用（10μM）
  1μl
  
  模板DNA
  25 ng
  
  ddH ₂ O
  至25μl
  
  循环条件 PCR：
  
  循环条件 PCR：
2. 使用含有20-25ng探针DNA的ddH 2 O，将反应混合物（提供为含有脱水的随机引物，dNTP，缓冲液和辅因子的0.2ml管）重构成最终体积为44μl，如所建议的在Prime-It RmT随机引物标签试剂盒中。在95℃下加热5分钟
3. 加入1.5μl的p-d标记的dCTPs和3μlMagenta聚合酶（标记试剂盒中带有红帽的管）。在37°C孵育8-10分钟。
4. 加入2μl停止混合物（标签试剂盒中带有绿色帽子的管）。
5. 使用快速旋转柱分离标记的DNA（探针）与未掺入的标记核苷酸进行放射性标记的DNA纯化。
6. 将探针在95℃加热5分钟使DNA变性
7. 将管置于冰上5分钟，然后快速旋转以收集管底部的探针。
Southern印迹测定（膜杂交）
1. 将探针加入杂交管。根据放射性的新鲜度，如上所述制备的一个探针足以标记2-4个膜。
2. 在杂交炉中在65℃孵育过夜。
3. 在0.5×尼龙清洗液中，在65℃下将膜洗涤20分钟
4. 在65℃下将0.1×尼龙洗涤溶液中的膜洗涤20分钟。
  注意：如果需要额外的洗涤，请使用0.01x尼龙清洗液重复洗涤步骤。
5. 将膜暴露于Phosphoimager屏幕至少2小时。
  注意：获取最佳信号所需的曝光时间长短取决于信号的强度。
6. 使用台风荧光粉成像仪获取图像。可以使用ImageQuant分析软件（GE Healthcare）进行图像分析。

数据分析

使用ImageQuant分析软件（GE Healthcare）分析按照上述程序获取的凝胶图像。在不同条件下AAV复制的水平与对应于与病毒（Rep）探针杂交的DpnI处理的样品中的病毒复制中间体的条带的强度成比例（图3）。对于wt AAV2病毒，分别为约4.7kb和9.4kb的单体和二聚体分子应该是可见的。还可以存在另外更高分子量的中间体。与Amp 探针杂交的膜片可以评估转染的效率和DpnI消化的功效（图3）。如果需要定量波段比较，ImageQuant软件通过光密度计支持频带量化

图3.通过Southern印迹分析AAV复制中间体。左图：pAAV-GFP（no Rep 对照），pAV2（WT AAV质粒）和pAV2-RepK340H（+ Ad）或不存在腺病毒转染（复制缺陷型突变体）。探针结合所有含氨苄青霉素抗性基因的质粒。 Rep 探针仅与含有AAV Rep 基因的DNA结合。右图：样品用IpI消化处理以除去所有输入质粒;检测到仅从质粒中拯救并复制的AAV DNA。在腺病毒存在（+ Ad）或不存在时转染质粒pAAV-GFP和pAV2。用 Amp 探针杂交确认所有输入质粒通过DpnI处理消化。 Rep 探针检测到复制的AAV DNA。 M：单体复制形式; D：二聚复制形式;较大的复制中间体在上面可见。改编自Bardelli等。，2016。

笔记

步骤D3至E5应仅在指定用于放射性工作的区域执行。请遵守本地指令。
关于对照的注意事项：运行该测定时应使用几个对照。

+ AAV， - 腺病毒：无复制控制。在没有腺病毒的情况下，AAV复制不存在或非常低
- Rep ，+腺病毒：无复制控制。代替wt AAV，使用复制缺陷型AAV突变体或重组AAV载体（例如pAAV-GFP）。这也将控制在实验中使用的腺病毒批次中不存在wt AAV污染。
使用 Amp 探针来确保输入DNA被消化。
否控制：允许不同条件之间输入质粒的比较，以及用于结合Amp 探针的对照。

食谱

Hirt裂解缓冲液
6 ml 10％SDS
1毫升1M Tris（pH 7.5）溶液
2ml 500mM EDTA（pH8.0）溶液
使用ddH 2 O
使最终体积达到100ml
TAE（Tris-acetate-EDTA）缓冲液
准备50x解决方案：
242克Tris
57.1毫升冰醋酸
100ml 500mM EDTA（pH8.0）溶液
将最终音量设置为1 L ddH 2 O
在ddH 2 O中稀释1:50，使1x TAE缓冲液
20x盐水柠檬酸钠（SSC）溶液
175.3克NaCl
88.2克柠檬酸钠
将最终音量设置为1 L ddH 2 O
变性溶液
300 ml 5 M NaCl溶液
100ml 5 M NaOH溶液
带有ddH 2 O的
中和解决方案
500毫升1M Tris（pH 7.4）溶液
300 ml 5 M NaCl溶液
带有ddH 2 O的
尼龙洗液（pH 7.2）
40.6g Na 2 HPO 4
18.65g EDTA
500克SDS
使最终体积达到3.58L，ddH <2> O

致谢

这项工作得到辉瑞稀有疾病联盟奖（EH），NIH授予RO1-GM092854（CRE）和英国医学研究理事会授予1001764（RML）的支持。

参考

Bardelli，M.，Zarate-Perez，F.，Agundez，L.，Linden，RM，Escalante，CR and Henckaerts，E.（2016）。确定与功能相关的Adeno相关病毒Rep68寡聚体界面。 J Virol 90（15 ）：6612-6624。
Graham，FL和Prevec，L。（1991）。操纵腺病毒载体。方法分子生物学7：109-128。
Hirt，B.（1967）。选择性提取多瘤来自感染的小鼠细胞培养物的DNA。 J Mol Biol 26（2）：365-369。
Im，DS and Muzyczka，N。（1990）。 AAV起始结合蛋白Rep68是具有DNA解旋酶活性的ATP依赖性位点特异性内切核酸酶。细胞 61（3）：447-457。
Laughlin，CA，Tratschin，JD，Coon，H.and Carter，BJ（1983）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6352411"target ="_ blank">细菌质粒中感染性腺相关病毒基因组的克隆基因 23（1）：65-73。
Rose，JA，Berns，KI，Hoggan，MD和Koczot，FJ（1969）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5264145 "target ="_ blank">单链腺病毒相关病毒基因组的证据：病毒DNA释放时形成DNA密度杂合物。美国Proc Natl Acad Sci USA 64（3））：863-869。
Samulski，RJ，Berns，KI，Tan，M.和Muzyczka，N。（1982）。将腺相关病毒克隆到pBR322中：从人类细胞中的重组质粒中拯救完整病毒。Proc Natl Acad Sci USA 79（6）：2077-2081。
Southern，EM（1975）。检测特定序列通过凝胶电泳分离的DNA片段。分子生物 98：503-17。
Straus，SE，Sebring，ED和Rose，JA（1976）。