材料和试剂

移液器吸头（10，20，200，1,000μl）
6孔板（Corning，目录号：3516）
10厘米盘（Greiner Bio One International，目录号：664160-013）
24孔玻璃底板（IWAKI，目录号：5826-024）
HeLa细胞（ATCC，目录号：CRM-CCL-2）
基于pEGFP（Clontech）或piggybac系统（Sato等人，2016）编码H4K20me1薄荷体的纯化质粒DNA（〜1μg/μl）和Halo-SUV420H1（Kazusa DNA Research Institute; FlexiHaloTag克隆FHC01413）
含有L-Gln和丙酮酸钠（Nacalai Tesque，目录号：08458-16）的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM），高葡萄糖（4g/L）
L-谷氨酰胺 - 青霉素 - 链霉素溶液（Sigma-Aldrich，目录号：G1146-100ML）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10270106）}
FuGENE HD（Promega，目录号：E2312）
Opti-MEM介质（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：31985070）
G-418二硫酸盐水溶液（Nacalai Tesque，目录号：16513-26）
FluoroBrite DMEM（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：A1896701）}
HaloTag TMR配体（Promega，目录号：G8251）

注意：

H4K20me1-scFv的核苷酸序列可在公开数据库（DDBJ/EMBL/GenBank）中以登录号LC129890获得。质粒DNA可根据要求提供给作者。
用于产生H4K20me1薄荷体的原始H4K20me1特异性抗体（Hayashi-Takanaka等，2015）可商购（MBL International，目录号：MABI0421）。

设备

CO ₂孵化器
移液器（10，20，200，1,000μl）
35毫米玻璃底盘，1.5号盖玻片（MATTEK，目录号：P35G-1.5-14-C）
荧光显微镜（Nikon Instruments，型号：ECLIPSE Ti-E）由NIS元件操作并配备：
旋转盘共焦单元（横河电机，型号：CSU-W1）
EM-CCD相机（Andor，型号：iXon3 DU888 X-8465）
物镜（Plan Apo 40x DIC M N2 [NA 0.95]）
激光单元（Nikon Instruments，型号：LU-N4）
加热阶段（东海命中）
CO 2子控制系统（Tokken）

软件

NIS元素ver。 4.30（尼康乐器）
Excel（Microsoft）

程序

建立表达H4K20me1薄荷体的稳定细胞系（图2）
注意：当使用原代细胞时，可以使用细胞分选，而不是建立抗生素抗性克隆。

图2.制备表达H4K20me1薄荷体和Halo-SUV420H1的细胞的方案
1. 根据标准方案（Freshney，2015），在37℃，5％CO 2气氛下，在补充有10％FBS和L-谷氨酰胺 - 青霉素 - 链霉素的DMEM中维持HeLa细胞。
2. 根据标准方案，使用FuGENE HD将编码H4K20me1-薄荷体的质粒DNA转染入细胞。通常，在转染前一天将细胞接种到6孔板（2×10 5个细胞在2ml培养基/孔中）。将2μg质粒和6μlFuGENE HD在100μlOpti-MEM中混合，将混合物在室温下放置5分钟，并将混合物加入含有2ml培养基的6孔板的一个孔中。将平板放入CO ₂孵化器。
3. 第二天，为了获得表达薄荷体的稳定细胞系，收获细胞，稀释至约10 3个细胞/ml，将平板细胞置于6孔板上（每孔2ml）或在含有1mg/ml G-418的FBS和L-谷氨酰胺 - 青霉素 - 链霉素的DMEM中的10cm皿（10ml /皿）。
4. 加入G-418后约两周，分离并扩增GFP阳性菌落。表达H4K20me1薄荷体的细胞的分离可以通过几种方式进行（Freshney，2015）。
5. 如果以高频（> 10％）观察到荧光菌落，则使用具有200μl尖端的微量移液管或使用克隆环随机挑取24个菌落，并转移到含有0.5ml的24孔玻璃底板中含有FBS和L-谷氨酰胺 - 青霉素 - 链霉素（不含G-418）的DMEM。
6. 如果荧光菌落很少被观察到，则在倒置的荧光显微镜下标记它们的位置之后拿起它们。几天后，使用具有高数值孔径和较短工作距离的干透镜（例如，Plan Apo 40x DIC M N2），在倒置荧光显微镜下研究每个孔中荧光的水平和分布[NA 0.95]）。如果可用，也可以使用细胞分选仪收集荧光细胞。
成像细胞准备
1. 在成像前两天，将平板细胞在35mm玻璃底盘（2ml培养基;〜2×10 5细胞/皿）中表达薄荷体。
2. 第二天，使用FuGENE HD将编码Halo-SUV420H1的质粒DNA转染到细胞中，将单甲基化的H4K20转化为三甲基化。使用2μg质粒和6μlFuGENE HD进行转染如上所述进行。横切效率通常会达到〜30％
3. 转染后一天，用含有0.1μMHalo TMR配体的10％FBS和L-谷氨酰胺 - 青霉素 - 链霉素代替培养基至FluoroBrite DMEM。在37℃，5％CO 2气氛下孵育细胞。
图像采集
1. 加入Halo TMR配体一小时后，将玻璃底盘放入加热台上。删除免费的TMR并不重要。然而，如果HaloTag标记的蛋白质的表达水平低，背景荧光妨碍检测，则应将细胞用含10％FBS和L-谷氨酰胺 - 青霉素 - 链霉素的FluoroBrite DMEM洗涤三次，然后将培养皿置于加热阶段。
2. 采用共焦焦显微镜，采用488和561 nm的激光线采集H4K20me1薄荷体（绿色通道）和TMR标记的Halo-SUV420H1（红色通道）的荧光图像，结合二向色镜DM405/488/561/640和发射过滤器分别为520/30和617/73

注意：

用0.1μMHalo TMR配体染色一小时通常足以标记HaloTag标记的蛋白质。然而，如果信号强度不够高，则样品可以与TMR配体孵育过夜。用10％FBS和L-谷氨酰胺 - 青霉素 - 链霉素洗涤氟乙酸DMEM也可提高信噪比。
为了避免荧光强度的饱和，我们简要扫描多个区域，并设置激光功率和曝光时间，以覆盖所有细胞（除了有时表现出最亮荧光的死细胞）在相机的动态范围内绿色和红色频道。
捕获的图像中的非转染细胞将用于阴性对照细胞。
经验上，至少需要30个光晕阳性细胞进行成像才能进行良好的统计分析。总共200个细胞，包括非转染细胞通常成像。

数据分析

H4K20me1的相对含量通过薄荷核的浓缩测定注意：为了比较不同细胞中H4K20me1-mintbody的核富集，测量每个细胞中的细胞核/细胞质强度比。
1. 使用NIS元素打开图像。
2. 选择没有单元格的区域来选择背景ROI。
3. 通过背景减法获取净强度图像。
4. 使用"绘制多边形ROI"工具手动绘制单元格和核心的ROI（图3）。核区域可以通过三维化和二值化自动选择，但由于细胞质中的信号强度低，通常难以选择细胞区域。对于数十个细胞的分析，手动绘图通常更快速准确;由于所选区域相当大，所以几个像素的差异不会太大。
5. 测量绿色通道中ROI的平均强度[I]，面积[A]和总强度[T = I x A]。
6. 将数据导出到Excel。
7. 在Excel中打开导出的数据，通过以下方程计算细胞质的强度：[I]细胞质=（[T]细胞 - [T]核）/（[A]细胞 - [A]核）。
8. 通过将细胞核的平均强度与细胞质的平均强度（即，比例= [I]细胞核/[I]细胞质）的比例计算核/细胞质强度比例。
  
  图3.绘制ROI以定义单元格和核区域。使用NIS元素分析的代表性图像文件。蓝色，Hoechst;绿色，H4K20me1薄荷;红色，光环SUV420H1。注意，在这里使用活的Hoechst染色，但这并不是必需的，因为核区域与细胞质明显区分开来。比例尺= 10μm
Halo-SUV420H1的表达水平
1. 上述定义的核的ROI区也可用于Halo-SUV420H1表达水平的相对量化。
2. 测量红色通道中核的平均强度
SUV420H1表达与H4K20me1的关系
1. 绘制散点图以显示SUV420H1表达水平与H4K20me1之间的关系（图4）。
  
  图4.H4K20me1-mintbody监测的活细胞中的H4K20me1水平。该图由Sato等人于2016年改编。Halo-SUV420H1在HeLa细胞中瞬时表达，稳定表达H4K20me1-mintbody。在表达SUV420H1（箭头）的细胞中，薄荷体在细胞质中更加扩散。绘制单细胞的核/细胞质强度比（右图）。核/细胞质比率取决于Halo-SUV420H1表达。 Bar = 10μm

笔记

该方案可适用于许多其他细胞系和修饰酶。为了确认活细胞观察，可以使用用于产生H4K20me1薄荷体的原始H4K20me1特异性抗体（Hayashi-Takanaka等人，2015; Sato ，使用基于固定细胞的免疫荧光分析， em> et al。，2016）。

致谢

这项工作得到JSP KAKENHI授予JP25118714，JP262910711，JP25116005的支持。协议已经由Sato等人（2016）进行了改编。

参考

Beck，DB，Oda，H.，Shen，SS and Reinberg，D。（2012）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22345514"target ="_ blank"> PR-Set7和H4K20me1：在基因组完整性，细胞周期，染色体凝聚和转录的十字路口。 Genes Dev 26（4）：325 -337。
Freshney，RI（2015）。动物文化细胞：基本技术和专业应用手册，第7版。 John Wiley&儿子。
Hayashi-Takanaka，Y.，Maehara，K.，Harada，A.，Umehara，T.，Yokoyama，S.，Obuse，C.，Ohkawa，Y.，Nozaki，N.，Kimura，H。（2015）。组蛋白H4修饰的分布由具体的单克隆抗体。染色体抗体23（4）：753-766。
Hayashi-Takanaka，Y.，Yamagata，K.，Wakayama，T.，Stasevich，TJ，Kainuma，T.，Tsurimoto，T.，Tachibana，M.，Shinkai，Y.，Kurumizaka，H.，Nozaki，N. ，Kimura，H。（2011）。跟踪表观遗传组蛋白使用基于Fab的活内源性修饰标记对单细胞进行修饰。核酸Res 39（15）：6475-6488。
Jørgensen，S.，Schotta，G.和Sorensen，CS（2013）。组蛋白H4赖氨酸20甲基化：基因组完整性的表观遗传调控的关键参与者。核酸Res 41（5）：2797-2806。
Kimura，H.，Hayashi-Takanaka，Y.，Stasevich，TJ，Sato，Y。（2015）。< a class ="ke-insertfile"href ="https：//www.ncbi.nlm.nih。 gov/pubmed/26138929"target ="_ blank">可视化体内内源性蛋白质的翻译后和表观遗传修饰。 Histochem Cell Biol 144（2）：101 -109。
Sato，Y.，Kujirai，T.，Arai，R.，Asakawa，H.，Ohtsuki，C.，Horikoshi，N.，Yamagata，K.，Ueda，J.，Nagase，T.，Haraguchi， Hiraoka，Y.，Kimura，A.，Kurumizaka，H。和Kimura，H。（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27534817"target ="_ blank">用于H4K20单甲基化的活细胞成像的遗传编码探针.Mol Biol。428（20）：3885-3902。 >
Sato，Y.，Mukai，M.，Ueda，J.，Muraki，M.，Stasevich，TJ，Horikoshi，N.，Kujirai，T.，Kita，H.，Kimura，T.，Hira，S.，Okada ，Y.，Hayashi-Takanaka，Y.，Obuse，C.，Kurumizaka，H.，Kawahara，A.，Yamagata，K.，Nozaki，N.and Kimura，H。（2013）。在体内追踪组蛋白修饰的遗传编码系统/a> 3：2436.