材料和试剂

移液器提示
24孔板（Corning，Falcon ^®，目录号：353047）
15ml离心管（Corning，Falcon ^®，目录号：352196）
G27针（Terumo，目录号：NN-2719S）
12孔板（Corning，Falcon ^®，目录号：353043）
细胞过滤器（尺寸：100μm）（Greiner Bio One International，目录号：542000）
10厘米盘（Corning，Falcon ^®，目录号：353003）
6孔板（Corning，Falcon ^®，目录号：353046）
6厘米盘（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^TM，目录号：150288）
96孔圆底板（Corning，Falcon ^®，目录号：351190）
用于程序C和D（Corning，Falcon ^®，目录号：353077）的96孔圆底板
StemPro EZ通道工具（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：23181010）
电池刮刀（IWAKI，目录号：9000-220）
0.22μm瓶顶过滤器（EMD Millipore，目录号：SCGVU05RE）
人类Vα24⁺ iNKT细胞
K562（ATCC，目录号：CCL-243）
OP9饲养细胞（从RIKEN BRC细胞编号RCB2926获得）
来自CytoTune-iPS 2.0的SeV-KOS和SeV-c-MYC（MEDICAL& BIOLOGICAL LABORATORIES，目录号：DV-0305-3A）
OP9DLL1饲养细胞（从RIKEN BRC细胞编号RCB2927获得）
外周血单核细胞（PBMC）
脐带血单核细胞（CBMC）
台盼蓝染色0.4％（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：T10282）}
具有SV40大T抗原（T）插入的SeV载体（SeV-SV40）（ID Pharma，定制顺序）
丝裂霉素C（Sigma-Aldrich，目录号：M4287）
iMatrix-511（Nippi，目录号：892 012）
StemFit AK02N（ReproCELL，目录号：RCAK02N）
用于人类ES/iPS细胞的冷冻培养基（DAP213）（ReproCELL，目录号：RCHEFM001）
干细胞银行家GMP级（Nippon Zenyaku Kogyo，Zenoaq，目录号：CB045）
0.25％胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：25200056）}
TripLE选择（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：12563011）
Y-27632，Rho相关的含盘绕圈蛋白激酶（ROCK）的抑制剂（和光纯药，目录号：253-00513）
Hanks不含酚红的平衡盐溶液（HBSS ⁺）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：084-08965）
胶原酶（Wako Pure Chemical Industries，目录号：036-23141）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）（和光纯药工业公司，目录号：045-29795）
干细胞因子（SCF）（R& D Systems，目录号：255-SC-050）
重组人白细胞介素-7（IL-7）（PeproTech，目录号：200-07）
Fms相关的酪氨酸激酶3（Flt-3）配体（R& D Systems，目录号：3008-FK-025）
重组人IL-15（PeproTech，目录号：200-15）
7-AAD染色溶液（BD，BD Biosciences，目录号：559925）
V450小鼠抗人CD3克隆UCHT1（BD，BD Biosciences，目录号：560365）
抗TCRVβ11-APC（Beckman Coulter，目录号：A66905）
抗TCRVα24-PE（Beckman Coulter，目录号：IM2283）
乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒（Takara Bio，目录号：MK401）
BD OptELISA人IFN-γ酶联免疫吸附测定（ELISA）组（BD，BD Biosciences，目录号：555142）
BD OptELISA人IL-4 ELISA组（BD，BD Biosciences，目录号：555194）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：T8787-100ML）
RPMI1640（Sigma-Aldrich，目录号：R8758）
胎牛血清（Sigma-Aldrich，目录号：172012-500ML）
青霉素 - 链霉素（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
汉克斯平衡盐溶液无酚红，无钙，无镁（HBSS ^-）（和光纯药公司，目录号：085-09355）
2- [4-（2-羟基乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）（Sigma-Aldrich，目录号：H3375-250G）
人IL-2（Shionogi，目录号：4987058697900）
灵长类ES细胞培养基（ReproCELL，目录号：RCHEMD001）
成纤维细胞生长因子碱性（bFGF）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：062-06661）
MEMα（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^TM，目录号：11900-073）
碳酸氢钠（NaHCO 3）（Nacalai Tesque，目录号：31213-15）
重组小鼠GM-CSF（PeproTech，目录号：315-03）
α-半乳糖神经酰胺（α-GalCer）（Funakoshi，目录号：KRN7000）
脂多糖（LPS）（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：00-4976-93）}
Dulbecco改性Eagle's培养基（D-MEM）（Wako Pure Chemical Industries，目录号：044-29765）
R10培养基（见食谱）
NKT媒体（见食谱）
人类多能干细胞培养基（见食谱）
OP9培养基（见食谱）
DC/Gal（参见食谱）
MEF培养基（见食谱）

设备

CO 3培养箱（35℃，37℃，38℃）（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，型号：Heracell ^TM 150i）}
倒置显微镜（Leica Microsystems，型号：DM IL LED）
立体显微镜（Leica，型号：MZ75）
P200移液器（Gilson，目录号：FA10005P）
流式细胞仪（BD，BD Biosciences，型号：FACSCanto II）
离心机（KUBOTA，型号：2800）
细胞计数器（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：C10227）}
控制率冷冻机（Grant Instruments，型号：EF600M）
OptEIA（BD，BD Biosciences，San Jose，CA）
酶标仪（Molecular Devices，型号：SpectraMax 190）

软件

FlowJo软件（FlowJo，LLC）

程序

来自人Vα24⁺ iNKT细胞的iPSC诱导第-3天
1. 将人类Vα24细胞在NKT培养基中以1×10 6个细胞/ml接种到24孔板（1×10 6个/细胞/孔），并如先前所述（Shimizu等人，2006; Yamada等人）用1×10 5 DC/Gal刺激。，2016）。
第0天
1. 通过移液将受刺激的人Vα24⁺ iNKT细胞（图1）收集到15ml离心管中，并通过台盼蓝染色计数活细胞数。将细胞重悬于1ml不含抗生素的R10培养基中，以1×10 6细胞/ml种子进入24孔板。
  
  图1.刺激的人类Va24 ⁺ iNKT细胞的代表性显微镜图像使用DC/Gal刺激人类Va24 iNKT细胞数天。
2. 使用人Vα24^{+ iNKT细胞将SeV（MOI：KOS，c-MYC，SV40 = 30,3,30）加入到24孔板中并轻轻混合。}
3. 在5％CO 2培养箱中在35℃下孵育。
第1天
1. 用1 ml完整的R10培养基更换培养基。
2. 在5％CO 2培养箱中在35℃下孵育。
第6天
1. 收集细胞并通过台盼蓝染色计数活细胞数。
2. 在丝裂霉素C处理的MEF或iMatrix-511涂布的6cm培养皿上，用3×10 5个细胞将完整的R10培养基和种子重悬细胞。
3. 在5％CO 2培养箱中在35℃下孵育。
第七天
1. 用人多能干细胞培养基（丝裂霉素C处理的MEF）或StemFit AK02N（涂覆在iMatrix-511上）更换培养基。
2. 在5％CO 2培养箱中在35℃下孵育。
3. 每隔一天更换培养基，直到出现人类ESC样菌落（图2）（Takahashi和Yamanaka，2006; Takahashi等人，2007）。
  
  图2.代表性的ESC样菌落形状。 ESC样菌落的直径约为1〜1.5mm
第21-28天
1. 在立体显微镜下使用G27针将每个人类ESC样菌落（直径约为1至1.5毫米）分成两个团块。通过移液将一个聚集体（约500个细胞）收集到管中，并进行人Vα24^{iNKT细胞特异性TRAV（Vα24-Jα18）重组检测（Yamada等人， em>，2016）。}
2. 将其他团块转移到丝裂霉素C处理的MEF或iMatrix-511涂覆的12孔板上，以便使用温和的移液法解离后进行细胞增殖。
3. 在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。
4. 使用StemPro EZ通道工具（丝裂霉素C处理的MEF）或TripLE选择（在iMatrix-511涂覆的）平板上维持细胞，如先前所述（Vizcardo等人，2013; Nakagawa et al。，2014）。使用人ES/iPS细胞（用于丝裂霉素C处理的MEF上的细胞）或干细胞储存器（用于iMatrix-511涂布板上的细胞）的冷冻培养基存储细胞。
Vα24^{iNKT-iPSC（iPS-NKT）的Vα24⁺ iNKT细胞的分化（图3）

图3.来自NKT-iPSC的iPS-NKT分化的示意图。将NKT衍生的iPSC（NKT-iPSC）分离成小团块，并在第0天接种在OP9饲养细胞上。在第13天，细胞转移到与OP9DLL1饲养细胞共培养。在第33天，收集细胞用于无饲养层培养另外10天。

第七天用0.25％胰蛋白酶-EDTA分离OP9细胞（约90％汇合）
通过细胞过滤器（大小：100μm）收集离解的OP9细胞，并在10ml的OP9培养基中于10cm培养皿中以6×10 5个细胞种子。

在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

第五天
加入10 ml OP9培养基
在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

第0天
用补充有10μMY-27632的新鲜OP9培养基代替OP9培养基。

使用立体显微镜下的StemPro EZ通道工具将人iPS细胞（80％融合）分离成团块。

在立体显微镜下使用P200移液管收集约100个胶囊（图4B），并将其放置在OP9种子的10厘米盘上。

在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

图4. iPS-NKT分化的代表性的NKT-iPSC morophology。使用EZ通道工具和移液将NKT-iPSC分成几个团块。 A.使用StemPro EZ通道工具切割后的NKT-iPSC的集落形状; B.通过移液和通入OP9饲养细胞制备和收集小NKT-iPSC团块。

第1天
用20 ml OP9培养基更换培养基。

在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

第9天
丢弃一半的上清（培养基）。

加入10 ml OP9培养基
在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

第12天
用0.25％胰蛋白酶-EDTA分离OP9DLL1细胞（约90％汇合）
通过细胞过滤器（大小：100μm）收集离解的OP9DLL1细胞，并在10 ml OP9培养基中的10cm皿上以2×10 6个细胞种子。

在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

第13天
弃去培养基，用10ml HBSS 冲洗细胞
加入6毫升胶原酶（20毫克/毫升）
在CO 2培养箱中37℃孵育45分钟。

弃去胶原酶，并用10ml D-PBS冲洗细胞
加入6 ml 0.25％胰蛋白酶-EDTA
在CO 2培养箱中37℃，30分钟孵育。

加入4ml OP9培养基，并收集通过细胞过滤器（大小：100μm）的离解细胞
在补充有10ng/ml SCF，5ng/ml人IL-7和5ng/ml Flt3-配体和板的10ml OP9培养基上重新悬浮收集的细胞，在OP9DLL1细胞接种的10cm皿（在第12天制备））。

第15天
用0.25％胰蛋白酶-EDTA分离OP9DLL1细胞（约90％汇合）
通过穿过细胞过滤器（大小：100μm）收集解离的OP9DLL1细胞，并在10 ml的OP9培养基中的10cm培养皿中以2×10 6个细胞种子。

在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

第16天
丝裂霉素C处理的OP9DLL1细胞的制备用补充有1μg/ml丝裂霉素C的6ml OP9培养基更换OP9DLL1细胞培养基。

在CO 2培养箱中孵育2小时，37℃，5％CO 2。

用D-PBS冲洗丝裂霉素C处理的OP9DLL1细胞两次，加入6ml OP9培养基。

在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

差异化iPS-NKT细胞的通过。通过移液并通过细胞过滤器（尺寸：100μm）分离收集细胞（在第13天制备）。

将收集的细胞用10μl补充有10ng/ml SCF，5ng/ml人IL-7和5ng/ml Flt3-配体和平板的OP9培养基重新悬浮在丝裂霉素-C处理的OP9DLL1细胞种植的10cm培养皿上。 >
在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

第24天
用0.25％胰蛋白酶-EDTA分离OP9DLL1细胞（约90％汇合）
通过通过细胞过滤器（尺寸：100μm）收集解离的细胞，并在10ml的OP9培养基中的10cm皿上以2×10 6个细胞种子。

在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

第25天
丝裂霉素C处理的OP9DLL1细胞的制备用补充有1μg/ml丝裂霉素C的6ml OP9培养基更换OP9DLL1细胞培养基。

在CO 2培养箱中37℃，5％CO 2孵育2小时。

用D-PBS冲洗丝裂霉素C处理的OP9DLL1细胞两次，加入6ml OP9培养基。

在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

差异化iPS-NKT细胞的通过通过移液并通过细胞过滤器（尺寸：100μm）分离收集细胞（在第16天制备）。

将收集的细胞重新悬浮在补充有10ng/ml SCF，5ng/ml人IL-7和5ng/ml Flt3-配体的平板的10ml OP9培养基和平板上的丝裂霉素C处理的OP9DLL1细胞种植的10cm培养皿上。 />
在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

第30天
加入补充有10ng/ml SCF，5ng/ml人IL-7和5ng/ml Flt3-配体（总共15ml）的5ml OP9培养基。

在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

第33天
通过细胞过滤器（尺寸：100μm）收集细胞。

通过台盼蓝染色计数活细胞数，并使用1×10 5个细胞通过流式细胞术分析iPS-NKT标记（CD3，TRAV24和TRBV11）表达。

将5×10 5个细胞/孔的iPS-NKT细胞接种到补充有5ng/ml人IL-7和10ng/ml人IL-7的2ml OP9培养基中的6孔板中15.

在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

第35,37,39和41天
加入1ml补充有5ng/ml人IL-7和10ng/ml人IL-15的OP9培养基
在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。

第43天
通过移液并通过细胞过滤器（尺寸：100μm）收集iPS-NKT细胞（图5）。

图5.代表性增殖的iPS-NKT细胞观察到活化的T细胞样形态。

通过台盼蓝染色计数可行的iPS-NKT细胞数，并使用1×10 5个细胞通过流式细胞术分析iPS-NKT标记（CD3，TRAV24和TRBV11）表达（图6）。 >
此时可以使用iPS-NKT细胞进行功能测定，如抗肿瘤细胞系检测或细胞因子生成测定。

图6.使用流式细胞仪分析代表性的iPS-NKT细胞。使用FSC和SSC如椭圆所示选择淋巴细胞分数。 B.活细胞由7-AAD阴性部分选择。 C.选择CD3阳性部分，将TRAV24和TRBV11阳性细胞表示为正方形}

细胞因子生产测定
1. 将iPS-NKT细胞接种在96孔圆底板（1×10 5个细胞/孔/200μl）上。
2. 细胞与或不与小鼠DC/Gal（1×10 5个细胞/孔）共同培养24小时，37℃，37℃，5％CO 2 >在CO ₂孵化器中。用OptEIA测量培养上清液中IFN-γ和IL-4的量。
抗肿瘤细胞系检测
1. 在96孔圆底板中，E/T比为5或10的效应细胞与1×10 4个靶细胞一起培养。
2. 在CO 2培养箱中37℃，5％CO 2孵育6小时后，收集100μl上清液，用LDH细胞毒性检测试剂盒测定LDH活性在96孔平底板中。
  1. 作为阳性对照，使用用2％Triton X-100裂解的靶细胞。
  2. 作为背景控制，使用效应细胞或靶细胞。
3. 在使用LDH试剂盒的抗肿瘤分析中在490nm和600nm处用SpectraMax 190测量。在490nm处从O.D.中减去。在600 nm作为噪声。杀灭活性用下列公式计算：杀死活性= [{（"效应子+靶"的OD - 培养基的OD） - （单独的OD的OD - 培养基的OD）} - （单独的效应物的OD - 培养基的OD）] /（阳性对照OD值 - 单独OD值）×100（％）

数据分析

我们将Vα24⁺ iNKT细胞重新编程到来自4个供体的iPSC中，并使用iPSC系选择的核型稳定性。为了评估表型，我们使用FlowJo软件（FlowJo，LLC）来处理使用FACSCanto II获得的iPS-NKT细胞的流式细胞术数据。在细胞因子产生测定中，我们进行4到7次独立实验，其中2至3个孔重复，并且用Student's检验统计分析汇总结果。在抗肿瘤细胞系检测中，我们进行了一式三份重复的8次独立实验，并用Student's检验统计分析了数据。我们在我们的原始论文（Yamada等人，2016）中描述了图2A中的细胞因子产生测定中的重复细节以及图2B中抗肿瘤细胞系测定（Yamada < em> et al。，2016）。

笔记

在所有研究中，我们验证了至少4个独立实验中我们的iPS-NKT细胞流式细胞术数据，细胞因子产生测定和抗肿瘤效应的重现性。总之，我们成功地将四种不同的Vα24⁺ iNKT细胞重新编程到iPSC中，并将其中的三个再生成Vα24⁺ iNKT细胞。在用DC/Gal刺激后，这些iPS-NKT细胞总是表现出高的IFN-γ产生活性（大于30ng/ml）和低IL-4产生（低于0.3ng/ml）。在用DC/Gal或细胞因子（IL-7 + IL-15）刺激后，iPS-NKT细胞总是显示出对肿瘤细胞系的高细胞毒性（对K562白血病细胞系超过50％）。这些结果非常重现。在我们手中，我们观察到针对K562白血病细胞的iPS-NKT细胞的高杀伤活性，即50-70％。
作为额外的笔记和技术提示，我们讨论了以下重要项目。由于细胞增殖可能取决于FCS的大量，我们已经测试了不同批次培养OP9饲养细胞（图7）。在抗肿瘤细胞系测定中，我们注意在培养iPS-NKT细胞和靶向肿瘤细胞之前去除死细胞，因为死细胞可能导致高背景。

图7.代表性的OP9饲养细胞形态培养48小时（在10cm培养皿中以6×10 5个细胞接种），超过3×10 4个观察10cm皿中的OP9饲养细胞（约90％汇合）
在iPSC诱导的第6天，在24孔板中有1×10 6个至1.5×10 6个细胞。我们通常在21-28日观察200-300个ES样殖民地。
在第33天，从约5×10 4个NKT-iPSC获得约1×10 6个iPS-NKT细胞，最后这些细胞可以在10天8天内增殖在用IL-7和IL-15刺激后。对于临床使用，我们可以将OP9DLL1种子10厘米的菜增加到十个菜，产生约5×10 7个iPS-NKT细胞。
丝裂霉素C处理的MEF如前所述（Conner，2001）以小的修饰制备。

用补充有1μg/ml丝裂霉素C的6ml MEF培养基代替MEF的培养基
在CO 2培养箱中37℃，5％CO 2孵育2小时。
用D-PBS冲洗丝裂霉素C处理的MEF两次，加入6ml MEF培养基
在37℃，5％CO 2培养箱中孵育。
也可以使用从ReproCELL购买的丝裂霉素C治疗的MEF。

我们通常从可以储存在液氮中直到使用的外周血或脐血的2-4×10 7个单核细胞开始。将PBMC或CBMC在补充有10％FBS和100U/ml hIL-2的RPMI中培养，并用α-GalCer（100ng/ml）刺激10-14天。细胞用FITC缀合的抗人Va24抗体，然后用抗FITC MACS珠（Miltenyi Biotech，10μl珠至10μg/ml）细胞染色。根据制造商的方案，通过使用LS柱（Miltenyi Biotech，纯度> 95％）对Vα24⁺ iNKT细胞进行阳性纯化。纯化的Vα24细胞在完全的NKT培养基中培养。我们通常从一个供体获得约200万个Vα24⁺ iNKT细胞。

食谱

R10中等
RPMI1640包含以下补充：
10％胎牛血清（FBS）
100 U/ml青霉素
100μg/ml链霉素
10 mM HEPES
NKT培养基
含有人IL-7（5ng/ml），人IL-15（10ng/ml）和人IL-2（100U/ml）的R10培养基
人多能干细胞培养基
含有bFGF（10ng/ml）的灵长类ES细胞培养基
OP9中等
将MEMα粉末和2.2g NaHCO 3溶解在1L蒸馏水中，并使用0.22μm瓶顶过滤器
最后，添加以下补充：
100 U/ml青霉素
100μg/ml链霉素
20％胎牛血清（FBS）
DC/Gal
在重组GM-CSF（20ng/ml）存在下，在24孔板中培养耗尽CD4，CD8，II类和B220阳性细胞的小鼠骨髓细胞。骨髓来源的DC在第6天用100ng/ml的α-GalCer脉冲48小时，并通过在最后24小时加入LPS（100ng/ml）刺激
MEF中等 D-MEM包含以下补充：
15％胎牛血清（FBS）
100 U/ml青霉素
100μg/ml链霉素

致谢

我们非常感谢教授。 P.D.对于手稿的批判性阅读而言。我们要感谢Genta Kitahara，Momoko Okoshi，小林小林，Maki Sakurai的技术援助。这项工作得到了日本医学研究与发展机构（AMED）和日本科技局CREST研究中心实现再生医学网络的支持。该方案是从以前的研究中修改过的，我们用鼠iPS-NKT细胞和人iPS-T细胞（Watarai等人，2010; Vizcardo等人） 2013）。

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