第一部分硝酸盐的测定（NO <3> ^sup>）

材料和试剂

0.1-10μl移液器吸头（NIPPON Genetics，目录号：30470）

1-200μl移液器吸头（NIPPON Genetics，目录号：30430）

100-1,000μl移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：111-N-Q）}

2.0毫升带O型圈的微管（SARSTEDT，目录号：72.693）

1.5毫升微管（WATSON，目录号：131-5155C）

分析板（岩崎，目录号：3881-096）

手套和眼睛护理

拟南芥生态型Col-0

超纯水（Milli-Q，Millipore，18MΩcm）

液体N 2

硫酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：192-04696）

水杨酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-14861）

氢氧化钠（和光纯药，目录号：198-13765）

硝酸钾（Wako Pure Chemical Industries，目录号：160-04035）

反应试剂1（参见食谱）

反应试剂2（见配方）

设备

移液器（Nichiryo，型号：Nichipet EX II）

热块（TAITEC，型号：DTU-1B）

冷冻离心机（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：MX-300）

涡旋搅拌机（Scientific Industries，目录号：SI-0236）

多模板读卡器（PerkinElmer，型号：EnSpire ^® 2300）
注意：多功能分光光度计是可行的。

分光光度计（Shimadzu，型号：UV-1650PC）

程序

从拟南芥芽或根中提取硝酸盐

消毒并称重新鲜的芽或根，将它们放入具有O形环的2ml微管中，并将其冷冻在液体N 2中。
注意：样品可以储存在-80°C使用前。我们通常使用10-50毫克样品（鲜重）进行硝酸盐测量。硝酸盐可以从液体N 2中被粉碎的样品中提取出来（Xu等，2016）。我们常常使用整枝或根茎进行提取。

加10卷超纯水。
注意：添加水的体积是基于假定来自1mg鲜重的淀粉的体积约为1μl。加入80℃预热的水更快地变性硝酸还原酶，避免硝酸盐在提取过程中的代谢。整个样品应浸没在水中。

在100°C孵育20分钟，盖子关闭。
注意：应每5分钟用手摇动或旋转管，以完全提取。

将冷却的管在20,400×g下在室温下离心10分钟。使用上清液进行硝酸盐测定。
注意：上清液可以储存在-80°C使用前。

从A测定硝酸盐。 thaliana 芽或根

加入40μl反应试剂1（参见食谱）至1.5 ml微量管，以确定硝酸盐的浓度

将40μl硫酸代替反应试剂1加入1.5ml微量管中，以确定非特异性背景浓度。

加入10μl上清液注意：上清液常常粘稠。我们通常将上清液附着在微管的壁上。

旋转内容并彻底旋转它们。

在室温下孵育20分钟注意：培养温度通常保持在20-25℃。

轻轻加入1ml反应试剂2（参见食谱），并涡旋直至内容物澄清注意：这种中和过程产生热量。获得的黄色产品在黑暗中稳定48小时。

使用分光光度计测量410 nm处的吸光度

制备硝酸盐标准曲线

在超纯水中使用硝酸钾（0,0.125,0.25,0.5,1,2,4和8mM）制备硝酸盐稀释系列。
注意：稀释系列可以储存在-20°C。

加入40μl反应试剂1至1.5 ml微管

加入10μl标准溶液

旋转内容并彻底旋转它们。

在室温下孵育20分钟

轻轻加入1ml反应试剂2，涡旋直至内容物澄清

使用分光光度计测量410nm处的吸光度并构建标准曲线（图1）。代表硝酸盐稀释系列的图片如图2所示

图1.使用已知浓度的硝酸盐在410nm处的吸光度生成的标准曲线

图2.代表性硝酸盐稀释系列的图片

数据分析

典型的硝酸盐标准曲线如图1所示。从曲线可以使用以下公式确定硝酸盐浓度（mM）：（Abs 截距）/斜率。

使用标准曲线计算上清液的表观硝酸盐浓度（mM）。

使用标准曲线计算上清液的非特异性背景浓度（mM）

通过从表观值减去非特异性值计算上清液的真实硝酸盐浓度（mM）

使用以下公式确定样品的硝酸盐含量（μmolg ^{-1）[真硝酸盐浓度（mM）]×[提取体积（ml）]/[鲜重（g）] 。}

笔记

硫酸，水杨酸和氢氧化钠对人类和环境非常危险和有害。戴手套和眼睛保护，并妥善丢弃废液。在进行实验之前，请确保进行风险评估。每个样品和标准应至少进行两次技术复制。为了获得可靠的统计分析数据，需要五种以上的生物重复。在上述实验程序中，测定限于1.25-80μmol硝酸盐g ^{-1重量的范围。如果结果超过此限制，则应根据样品的硝酸盐浓度，使用超纯水适当稀释萃取物。}

食谱

反应试剂1
0.05％（w/v）水杨酸在硫酸中每天准备新鲜，避免暴露于光线

反应试剂2
8％（w/v）NaOH在超纯水中
储存于4°C的聚丙烯螺旋盖管中，盖子紧紧关闭

第二部分。亚硝酸盐的测定（NO 2 ^-）

材料和试剂

0.1-10μl移液器吸头（NIPPON Genetics，目录号：30470）

1-200μl移液器吸头（NIPPON Genetics，目录号：30430）

100-1,000μl移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：111-N-Q）}

2.0 ml安全锁管（Eppendorf，目录号：0107-23-31-33）

5毫米氧化锆珠（BMS，目录号：ZZ50-0001）

1.5毫升微管（WATSON，目录号：131-5155C）

分析板（岩崎，目录号：3881-096）

手套和眼睛护理

拟南芥生态型Col-0

液体N 2

1mol/L盐酸（Nacalai Tesque，目录号：37314-15）

2- [4-（2-羟基乙基）-1-哌嗪基]乙磺酸（HEPES）（Dojindo，目录号：342-01375）

乙二胺-N，N，N'，N'-四乙酸（EDTA），二钠盐，脱水剂（Dojindo，目录号：345-01865）

L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：168149）

磺胺（和光纯药，目录号：191-04502）

<> -1-萘磺乙二胺二盐酸盐（和光纯药工业公司，目录号：147-04141）

超纯水（Milli-Q，Millipore，18MΩcm）

提取试剂1（参见食谱）

反应试剂3（见配方）

反应试剂4（参见食谱）

设备

移液器（Nichiryo，型号：Nichipet EX II）

带珠的样品破坏剂（QIAGEN，型号：TissueLyser II）
注意：砂浆和杵是可行的。

冷冻离心机（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：MX-300）

涡旋搅拌机（Scientific Industries，目录号：SI-0236）

多模板读卡器（PerkinElmer，型号：EnSpire ^® 2300）
注意：多功能分光光度计是可行的。

分光光度计（Shimadzu，型号：UV-1650PC）

程序

从A提取亚硝酸盐。 thaliana 芽或根

将新鲜的枝条或根（新鲜重量约50-100毫克）消毒并称重，将其放入2毫升安全锁管中，并将其冻结在液体N 2中。
注意：我们尚未检查冻结样品是否可储存。我们建议尽快将样品用于提取和测量亚硝酸盐。

使用5毫米氧化锆珠（每管一个珠）或在液态N 2条件下用研钵和研杵将样品破碎机粉碎成细粉末。

加5卷的萃取剂1（参见食谱），轻轻旋涡直至溶液溶解并变得均匀，并将提取物保持在冰上。
注意：添加的提取缓冲液的体积是基于来自1mg鲜重的淀粉的体积约为1μl的假设来确定的。

在40℃下将提取物离心10分钟，4℃。使用上清液进行亚硝酸盐测定。
注意：上清液可用于测量硝酸还原酶活性（Konishi和Yanagisawa，2011）。

从A确定亚硝酸盐。 thaliana 芽或根

将150μl上清液与150μl反应试剂3（参见食谱）在1.5 ml微量管中混合，以确定表观亚硝酸盐浓度。

用150μl1 mol/L盐酸代替反应试剂3混合150μl上清液，以确定非特异性背景浓度。

在4℃下以20,400×g离心混合物10分钟以除去沉淀物。

将100μl上清液与100μl反应试剂4混合（参见食谱）。
注意：上清液：试剂3：试剂4 = 1:1:1（v/v/v）。如果需要较大的体积来测量吸光度，则可以将该混合物放大。

在室温下孵育15分钟

使用分光光度计测量540 nm处的吸光度

制备亚硝酸盐标准曲线

在提取试剂1（新鲜制备的）中，使用亚硝酸钾（0,5,10,20和40μM）制备亚硝酸盐稀释系列。
注意：在正常生长条件下的大多数植物中（缺氧/缺氧或抑制亚硝酸盐的除外），组织中积累了少量亚硝酸盐。标准曲线的范围应根据样品类型进行调整。

混合均等的标准溶液。的反应试剂3和反应试剂4在1.5ml微量管中

在室温下孵育15分钟

使用分光光度计测量540 nm处的吸光度（图3）。代表性亚硝酸盐稀释系列的图片如图4所示

图3.使用已知亚硝酸盐浓度的540 nm处的吸光度生成的标准曲线

图4.代表性亚硝酸盐稀释系列的图片

数据分析

典型的亚硝酸盐标准曲线如图3所示。从曲线可以使用以下公式确定亚硝酸盐浓度（μM）：（Abs> 540 - 截距）/斜率。

使用标准曲线计算上清液的表观亚硝酸盐浓度（μM）

使用标准曲线计算上清液的非特异性背景浓度（μM）

通过从表观值中减去非特异性值，计算上清液的真实亚硝酸盐浓度（μM）

使用以下公式确定样品的亚硝酸盐含量（nmol g ^{-1重量）[真硝酸盐浓度（μM）]×[提取体积（ml）]/[鲜重（g）] 。}

笔记

亚硝酸盐溶液不太稳定。提取和确定应尽快进行。盐酸对人类和环境非常危险和有害。戴手套和眼睛保护，并妥善丢弃废液。在进行实验之前，请确保进行风险评估。每个样品和标准应至少进行两次技术复制。为了获得可靠的统计分析数据，需要五种以上的生物重复。在上述实验程序中，测定限于25-200nmol亚硝酸盐g ^-1鲜重的范围。如果结果超过此限制，则应根据样品的亚硝酸盐浓度，使用萃取剂1适当稀释萃取液。亚硝酸盐在有限的还原当量供应量的情况下积累在亚硝酸盐还原被抑制的组织中（Hachiya等人，2016）。

食谱

提取试剂1
50mM HEPES-KOH（pH 7.6）
1 mM EDTA
7 mM半胱氨酸
注意：使用前加入半胱氨酸。高压灭菌后，在4℃下储存无半胱氨酸溶液。

反应试剂3
1％（w/v）磺胺在1mol/L盐酸中的溶液每天准备新鲜

反应试剂4
在超纯水中0.02％（w/v）N 1 - 萘乙二胺二盐酸盐
每天准备新鲜

第三部分。铵（NH 4 ⁺）的测定

材料和试剂

0.1-10μl移液器吸头（NIPPON Genetics，目录号：30470）

1-200μl移液器吸头（Nippon Genetics，目录号：30430）

100-1000μl移液器吸头（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：111-N-Q）}

2.0 ml安全锁管（Eppendorf，目录号：0107-23-31-33）

5毫米氧化锆珠（BMS，目录号：ZZ50-0001）

1.5毫升微管（WATSON，目录号：131-5155C）

手套和眼睛护理

分析板（岩崎，目录号：3881-096）

拟南芥生态型Col-0

超纯水（Milli-Q，Millipore，18MΩcm）

液体N 2

氯仿（和光纯药，目录号：038-02606）

酸洗活性炭（Wako Pure Chemical Industries，目录号：035-18081）

1mol/L盐酸（Nacalai Tesque，目录号：37314-15）

氨测试试剂盒（氨测试和光，和光纯药工业公司，目录号：277-14401）
注意：

这种便宜的试剂盒基于Okuda-Fujii方法的改进（Okuda和Fujii，1965）确保了铵的可靠测量。

氨检测试剂盒即用即可，可在4℃保存一年半。代替使用试剂盒，可以使用基于Bräutigam等人的方法的商业试剂制备反应试剂。（2007）。

提取试剂2（参见食谱）

设备

移液器（Nichiryo，型号：Nichipet EX II）

带珠的样品破坏剂（QIAGEN，型号：TissueLyser II）
注意：砂浆和杵是可行的。

冷冻离心机（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：MX-300）

热块（TAITEC，型号：DTU-1B）

涡旋搅拌机（Scientific Industries，目录号：SI-0236）

微管混合器（TOMY DIGITAL BIOLOGY，型号：MT-360）

多模板读卡器（PerkinElmer，型号：EnSpire ^® 2300）
注意：多功能分光光度计是可行的。

分光光度计（Shimadzu，型号：UV-1650PC）

程序

从A提取铵。 thaliana 芽或根

将新鲜的枝条或根（大约10-100毫克鲜重）重新粉碎并称重，将其放入2毫升安全锁管中，并将其冻结在液体N 2中。
注意：样品可以在-80°C保存后再使用。

使用5毫米氧化锆珠（每管一个珠）或在液态N 2条件下用研钵和研杵将样品破碎机粉碎成细粉末。

加入1ml提取试剂2（参见食谱），轻轻涡旋，直至溶液溶解并变得均匀

加入500μl氯仿。

在4℃下轻轻旋转混合物15分钟

在12℃下将提取物离心10分钟，8℃

将水相转移到含有约50mg酸洗活性炭的1.5ml微量管中，然后涡旋混合物。

将提取物在20,400 x g处于8℃离心5分钟。使用上清液进行铵测定。
注意：一系列纯化步骤消除了用于铵测定的干扰化合物。

从A测定铵。 thaliana 芽或根

将200μl上清液与氨测试试剂盒中的800μl去蛋白试剂混合在1.5ml微量管中并涡旋。
注意：脱蛋白试剂含有钨酸钠和磷酸盐。

在4℃下以2,300×g离心混合物5分钟。

在氨测试试剂盒中将200μl上清液与200μl试剂A混合并涡旋注意：试剂A含有硝普钠和苯酚。

在氨测试试剂盒中加入100μl试剂B并涡旋注意：试剂B含有氢氧化钾。

在氨测试试剂盒中加入200μl试剂C并涡旋注意：试剂C含有次氯酸钠和碳酸钾。

在37℃孵育20分钟。

使用分光光度计测量630 nm处的吸光度注意：如果铵浓度超过标准稀释系列的范围，则用提取试剂2稀释上清液。通常，在含铵条件下生长的植物组织中，铵积累较高。

铵标准曲线的制备

在提取试剂2（新鲜制备）中，使用氯化铵（0,12.5,25,50,100,200和400μM）制备铵稀释系列。
注意：氨测试Wako包括稀释系列的制备方法。然而，它们的背景组成类似于脱蛋白血液，因为该试剂盒旨在测量血液中的铵。因此，稀释系列应用提取试剂3制备。

将200μl标准溶液与800μl脱蛋白试剂在氨测试试剂盒中，在1.5 ml微量管中混合，并旋涡。
注意：脱蛋白试剂含有钨酸钠和磷酸盐。

在800℃下将混合物在4℃下离心5分钟。

在氨测试试剂盒中将200μl上清液与200μl试剂A混合并涡旋

在氨测试试剂盒中加入100μl试剂B并涡旋

在氨测试试剂盒中加入200μl试剂C并涡旋

在37℃孵育20分钟。

使用分光光度计测量630 nm处的吸光度（图5）。代表性铵稀释系列的图片如图6所示

图5.使用已知浓度的铵的630 nm处的吸光度生成的标准曲线

图6. 代表性铵稀释系列的图片

数据分析

典型的铵标准曲线如图5所示。从曲线上可以用下列公式确定上清液中的铵浓度（μM）：（Abs> 630截距）/斜率。 >

用[铵浓度（μM）]×[提取体积（ml）]/[鲜重（g）]//确定样品的铵含量（μmolg ^1,000。

笔记

通风柜应使用氯仿。盐酸对人类和环境非常危险和有害。戴手套和眼睛保护，并妥善丢弃废液。在通风柜中应小心使用酸洗活性炭，以确保灰尘不会散落。在进行实验之前，请确保进行风险评估。每个样品和标准应至少进行两次技术复制。为了获得可靠的统计分析数据，需要五种以上的生物重复。在上述实验过程中，线性标准曲线并不总是在低于12.5μM或高于400μM的情况下实现。如果结果超过此限制，应根据样品的铵浓度，使用萃取剂2适当稀释萃取液。高铵含量在以毫摩尔浓度在铵下生长的植物中积累，但在硝酸盐条件下几乎不积聚铵（Hachiya等人，2012）。

食谱

提取试剂2
0.1mol/L盐酸

致谢

本程序来自于Cataldo等人的工作。（1975），Rockel等人（2002），Bräutigam等人（2007），Konishi和Yanagisawa（2011）和Hachiya等人（2012和2016）。这项工作得到了日本科技厅科技人力资源开发联盟和科技兴业核心研究的支持。

参考

Bräutigam，A.，Gagneul D.和Weber，APM（2007）。用于单次提取物中乙醛酸和铵的平行测定的高通量比色法.Anal Biochem 362（1）：151-153。

Cataldo，DA，Haroon，M.，Schrader，LE and Youngs，VL（1975）。< a class ="ke-insertfile"href ="https://www.researchgate.net/publication/249072446_Rapid_Colorimetric_Determination_of_Nitrate_in_Plant-Tissue_by_Nitration_of_Salicylic-酸"目标="_ blank">通过水杨酸硝化快速比色测定植物组织中的硝酸盐。通用土壤科学植物分析 6：71-80。

Hachiya，T.，Ueda，N.，Kitagawa，M.，Hanke，G.，Suzuki，A.，Hase，T。和Sakakibara，H。（2016）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27615794"target ="_ blank"> 拟南芥根型铁氧还蛋白：NADP（H）氧化还原酶2涉及解毒根系中的亚硝酸盐。植物细胞生理学57（11）：2440-2450。

Hachiya，T.，Watanabe，CK，Fujimoto，M.，Ishikawa，T.，Takahara，K.，Kawai-Yamada，M.，Uchimiya，H.，Uesono，Y.，Terashima，I.and Noguchi，K. （2012）。硝酸盐添加减轻铵毒性而不减少铵积累，有机酸消耗和拟南芥芽中的无机阳离子消耗。植物细胞生理学53（3）：577-591。

Konishi，M.和Yanagisawa，S。（2011）。控制拟南芥中硝酸还原酶基因（NIA1）的硝酸盐反应性表达的调节区。植物细胞生理52 （5）：824-836。

Okuda，H.和Fujii，S。（1966）。通过分光光度法测定血氨。 21：622-627。

Rockel，P.，Strube，F.，Rockel，A.，Wildt，J.和Kaiser，WM（2002）。< a class ="ke-insertfile"href ="https：//www.ncbi.nlm .nih.gov/pubmed/11741046"target ="_ blank">体外植物硝酸还原酶的体外调节一氧化氮（NO）的生成。 > J Exp Bot 53（366）：103-110。

Xu，N.，Wang，R.，Zhao，L.，Zhang，C.，Li，Z.，Lei，Z.，Liu，F.，Guan，P.，Chu，Z.，Crawford，NM and Wang ，Y.（2016）。拟南芥NRG2蛋白介导硝酸盐信号传导并与重要的硝酸盐调节剂相互作用和调控。植物细胞28（2）：485-504。