材料和试剂

PCR
1. 0.2毫升具有盖帽的PCR管（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM12225）}
2. 1.5 ml锥形基座螺旋盖管（USA Scientific，目录号：1415-8399）
3. 具有和不具有剪接位点变体（20ng /μl）的人类基因组DNA样品
4. TE缓冲液，10mM Tris 1mM EDTA pH8.0（Sigma-Aldrich，目录号：93283）
5. 定制合成的寡核苷酸引物将限制性内切酶位点引入5'末端（Integrated DNA Technologies; https://www.idtdna.com/site/order/oligoentry ）：
6. Phusion热启动II高保真DNA聚合酶（Thermo Fisher Scientific，Thermo Scientific ^{TM，目录号：F549S）}
7. 分子级水，无核酸酶（Dot Scientific，目录号：DS248700）
8. dNTP集（QIAGEN，目录号：201913）
9. 2 mM dNTPs（见配方）
凝胶电泳
1. 1M Tris盐酸盐溶液，Tris-HCl，pH 7.8（Sigma-Aldrich，目录号：T2569）
2. 3 M醋酸钠缓冲溶液，pH 5.2（Sigma-Aldrich，目录号：S7899）
3. 0.5 M EDTA，pH 8.0（Santa Cruz Biotechnology，目录号：sc-203932）
4. 琼脂糖（IBI Scientific，目录号：IB70042）
5. SYBR安全DNA凝胶染色（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：S33102）}
6. Ficoll-400（Dot Scientific，目录号：DSF10400-25）
7. 溴酚蓝，钠盐（MP Biomedicals，目录号：02152506）
8. 橙G（Sigma-Aldrich，目录号：O3756）
9. HyperLadder 1 kb（Bioline，目录号：BIO-33053）
10. 1x TAE缓冲区（见配方）
11. 1％或1.5％琼脂糖凝胶（参见食谱）
12. 10x凝胶加载染料（参见食谱）
克隆
1. 1.5ml Eppendorf管（VWR，目录号：20170-022）
2. 培养皿，100 x 15毫米（VWR，目录号：25384-302）
3. Whatman GD/X注射器过滤器，0.2μm孔径（Whatman，目录号：6901-2502）
4. BD 60 ml注射器，Luer-Lok Tip（BD，目录号：309653）
5. 巴斯德玻璃移液器，230毫米（用于在板上铺展细菌）（WHEATON，目录号：357335）
6. 2 ml冷冻，自立（Simport，目录号：T310-2A）
7. 50ml聚丙烯锥形管，Falcon（Corning，Falcon ^®，目录号：352070）
8. 0.5ml PCR管（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM12275）}
9. JM109大肠杆菌感受态细胞（Promega，目录号：L2001）
10. pSPL3载体（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen）
11. 限制性内切核酸酶，Xho I（New England Biolabs，目录号：R0146S）
12. 限制性内切核酸酶，Bam HI（New England Biolabs，目录号：R0136S）
13. QIAquick PCR纯化试剂盒（QIAGEN，目录号：28104）
14. T4 DNA连接酶（New England Biolabs，目录号：M0202S）
15. SOC培养基（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：15544034）}
16. Luria Bertani肉汤（Lennox）粉末微生物生长培养基（Sigma-Aldrich，目录号：L3022）
17. 选择Agar（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^TM，目录号：30391023）
18. 碳青霉素，二钠盐（Dot Scientific，目录号：DSC46000-5）
19. 甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G5516）
20. QIAprep Spin Miniprep Kit（QIAGEN，目录号：27104）
21. 碳青霉素抗生素，1,000x（参见食谱）
22. 含有羧苄西林抗生素的LB（Luria-Bertani）培养基（参见食谱）
23. LB琼脂与羧苄青霉素抗生素板（见食谱）
哺乳动物细胞培养
1. 血清移液管
  5 ml（Corning，Costar ^®，目录号：4487）
  10 ml（Corning，Costar ^®，目录号：4488）
  25 ml（Corning，Costar ^®，目录号：4489）
2. 转移移液管，聚乙烯，通用血库，灯泡抽取1.9 ml，无菌（Sigma-Aldrich，目录号：Z350699）
3. 巴斯德玻璃移液器，5.75"（用于吸入）（VWR，目录号：14673-010）
4. 具有0.2μm通气帽的25cm 2（T25）细胞培养瓶（Corning，目录号：430639）
5. COS-7哺乳动物细胞（ATCC，目录号：CRL-1651）
6. Dulbecco改良的Eagle's培养基，DMEM，+ GlutaMAX-1细胞培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10569010）}
7. 胎牛血清，FBS（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10437028）}
8. 磷酸盐缓冲盐水，PBS，pH 7.4,1x（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10010023）}
9. 青霉素 - 链霉素，10,000U/ml（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15140122）}
10. 胰蛋白酶-EDTA（0.5％），无酚红（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：15400054）}
11. FuGENE 6转染试剂（Promega，目录号：E2691）
12. Opti-MEM I减少血清培养基（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：31985062）}
RNA提取
1. RNeasy Mini Kit（QIAGEN，目录号：74104）
2. QIAshredder（一次性细胞裂解物均质器）（QIAGEN，目录号：79654）
cDNA生成
1. 具有RNA酶抑制剂的高容量cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Applied Biosystems ^{TM，目录号：4374966）}
RT-PCR
1. 0.2毫升具有盖帽的PCR管（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen ^{TM，目录号：AM12225）}
2. HotStarTaq DNA聚合酶（QIAGEN，目录号：203203）
3. TE缓冲液，10mM Tris 1mM EDTA pH8.0（Sigma-Aldrich，目录号：93283）
4. 载体特异性寡核苷酸引物（综合DNA技术; https：//www。 idtdna.com/site/order/oligoentry ）：
  1. V1-F：5'-TCTGAGTCACCTGGACAACC-3'
  2. V2-R：5'-ATCTCAGTGGTATTTGTGAGC-3'
  注意：重悬引物，并用TE缓冲液制备10μM储备液。
5. 2 mM dNTPs（见配方）
桑格测序
1. Sanger测序（GeneWiz商业测序服务; https：//www.genewiz.com/en/Public/Services/Sanger-Sequencing ）
2. 测序引物（V1-F和V2-R寡核苷酸引物，与RT-PCR相同）

设备

Gel doc系统（Labnet International，型号：Enduro ^TM GDS）
水浴（37℃）（Fisher Scientific，型号：Fisher Scientific ^TM Isotemp ^TM 215）
细菌摇床孵育器（37℃）（GeneMate，型号：Incubated Shaker Mini）
细菌培养箱（37℃）（Lab-Line Imperial III孵育器）
哺乳动物细胞培养箱（37℃，5％CO 2）（Eppendorf，型号：Galaxy 170S）
本森燃烧器，简单天然气燃烧器版本（Fisher Scientific，目录号：S95941）
NanoDrop Lite分光光度计（Thermo Fisher Scientific）
Eppendorf离心机（台式）（Eppendorf，型号：5415 D）
PCR热循环仪（Eppendorf，型号：MastercyclerPro S）
Pyrex瓶/瓶，500毫升
HotPlate Stirrer（GeneMate，型号：HotPlate Magnetic Stirrer）
VWR旋钮磁力搅拌棒，带有枢轴环的多边形，直径6 mm（¼"），长度35 mm（1""）（VWR，目录号：74950-290）
Fisher Vortex Genie 2（Thermo Fisher Scientific，目录号：12-812）
家用微波炉，1000W
凝胶电泳槽（和托盘）（Bio-Rad Laboratories，型号：Wide Mini-Sub GT Cell）
电泳电源组（Bio-Rad Laboratories，型号：PowerPac ^TM基本电源）
高压灭菌器（Medium Healthcare Sterilizer）（Tuttnauer，型号：6690）
生物安全柜（贝克公司，型号：SterilGARD e3高效SG403A-HE）
手持式吸气器和收集器阱（Argos Technologies，型号：EV514）

软件

Sequencher软件（版本5.2.4，Gene Codes Corporation; http：//www.genecodes。 com/sequencher ）
Primer3Plus（ http://primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi ）

程序

实验基因组片段的扩增
设计定制的寡核苷酸引物以扩增感兴趣的基因组区域并在其5'末端掺入限制性内切核酸酶位点，随时进行克隆。每个引物的5'末端还加入8 bp，以提高PCR后内切酶消化的效率。引物设计使用Primer3Plus执行（ http://primer3plus.com /cgi-bin/dev/primer3plus.cgi ）。对于第一个构建体，对外显子5（c.760 + 2T> C）的5'剪接供体位点内的变体进行建模，包含所有内含子4的TEK基因的1,457bp基因组片段，外显子5，内含子5，外显子6和内含子6被扩增。该gDNA序列缺乏XhoI和Bam HI核酸内切酶的识别位点，因此将这两个位点并入引物用于下游克隆。对于第二个构建体，对外显子22（c.3300 + 2delT）的5'剪接供体位点内的变体进行建模，其中包含所有内含子21，外显子22的831bp的TEK基因组基因组片段并扩增内含子22，并且还引入XhoI和Bam HI识别位点用于随后的克隆。 Phusion热启动II高保真DNA聚合酶用于扩增，因为其错误率低，扩展速度快，处理较大扩增子大小的能力。应该使用来自患者和对照受试者的基因组DNA作为扩增突变体和野生型基因组区域的模板。
注意：如果患者携带杂合突变，则可以从该单个gDNA样品中亚克隆突变体和野生型等位基因。
1. 在0.2ml PCR管中，如下设置20μlPCR反应：
  
  包括阴性对照样品（加入3μl水而不是gDNA），以测试DNA污染。
2. 使用"T _m Calculator"（ www.thermofisher.com ）计算适合的PCR循环退火温度。如果T m> 30％的值高于69℃，那么与两个TEK基因实例相同，使用72℃组合退火的2步循环方案推荐步骤。
3. PCR循环应执行如下：
4. 琼脂糖凝胶电泳应如下进行：
将基因组片段克隆到pSPL3外显子捕获载体中 PCR产物现在被纯化并插入到外显子捕获载体pSPL3的多克隆位点（MCS）中。 MCS位于载体外显子V1和V2之间的内含子区域内。首先，将PCR产物纯化以除去缓冲液，未掺入的dNTP和引物。然后，用相关的限制性内切酶消化载体和PCR产物，在这些实施例中，XhoI和BamHⅠ，再次纯化。然后将"粘性"载体和基因组"插入"片段连接在一起。连接产物转化成化学感受态的JM109E。大肠杆菌细胞并铺在含有羧苄青霉素抗生素的LB平板上，用于选择携带携带质粒的细菌。将板孵育过夜后，挑取几个细菌菌落，在液体培养物中长大，收获其质粒含量。然后将纯化的质粒DNA进行Sanger测序以验证哪个质粒克隆包含具有正确含量和取向的插入物。
1. 按照QIAGEN的说明，使用QIAquick PCR Purification Kit纯化PCR产物。这是"插入"DNA，应该是浓度为50-150 ng /μl。为了达到这一浓度，可能需要将3×20μlPCR反应物合并到每个纯化柱中，并在终体积为30μl的洗脱缓冲液（EB）中洗脱。
2. pSPL3质粒DNA也应在1x TE中纯化，或者来自QIAprep Spin Miniprep Kit纯化的EB。这是"载体"DNA，浓度应在200-400 ng /μl。如果需要使用Miniprep Kit从细菌中收获pSPL3质粒，请参阅本节的步骤7（"从细菌菌落生长和收获质粒"）。
3. 在0.5ml PCR管中设置限制性双重消化，如下所示：
  
  在37℃下在水浴中孵育2小时。
4. 按照QIAGEN的说明，使用另一个QIAquick PCR Purification Kit纯化消化的DNA产物。这消除了缓冲盐和不需要的小消化片段。将插入样品在30μlEB中洗脱，并将载体样品洗脱至50μlEB。对于插入物和载体，DNA浓度将为约50-70ng /μl。在这一点上，每个样品可以在1％琼脂糖凝胶上流出5μl，以检查片段是否具有预期的大小（对于 TEK 外显子5插入片段为1,463bp，对于 > TEK 外显子22插入片段，对于消化的pSPL3载体片段为6,011bp;图3）。
  
  图3.使用Bam HI和XhoI核酸内切酶进行限制性消化后，PCR产物和pSPL3载体的片段。分别在1,463bp和837bp分别观察到外显子5（E5）和外显子22（E22）片段。在6,011bp处观察到pSPL3载体（V）片段。未消化的超螺旋pSPL3载体（UV）样品也包含在凝胶上，迁移至约4,000bp。 1％琼脂糖凝胶;分子量标记物是每泳道5μl'HyperLadder 1 kb'。
5. 接下来，插入片段和载体片段将以3:1的摩尔比连接在一起。 NEBioCalculator工具（ https://nebiocalculator.neb.com /）对于计算实现这些摩尔比所需的插入量。线性化pSPL3载体片段为6.011kb，外显子5和外显子22插入片段分别为1.463kb和0.837kb。对于200ng载体DNA，分别需要146ng和84ng插入DNA。在0.2 ml PCR管中设置连接反应如下：
  
  注意：
6. 接下来，将结扎产物转化为有效的JM109E。大肠杆菌使用Promega提供的多用途协议的修改版本（需要使用较少的细胞）：
7. 从以下几个（5至10个）细菌菌落生长和收获质粒：
  1. 在收获质粒含量之前，将甘油储存的细菌培养物长期储存：
  2. 按照QIAGEN的指示，使用QIAprep Spin Miniprep Kit从剩余的过夜培养物中收获质粒含量。
  3. NanoDrop将质粒DNA样品定量产量。
  4. Sanger对纯化的质粒DNA进行排序，以验证哪个质粒克隆含有正确含量和取向的插入片段。一旦验证，这些是最终的迷你基因构建体 - 每个待测试的剪接变体的野生型和突变型小基因。
将微型基因构建体转染到COS-7细胞中接下来，COS-7哺乳动物细胞（来自非洲绿猴的肾脏的粘附的成纤维细胞样细胞）在培养物中生长，并且使用FuGene 6转染试剂将野生型和突变的小基因构建体转染到细胞中，Promega's说明：
1. 将COS-7细胞以25-40％汇合（6.25×10 5/sup> -1×10 -6）接种到25cm 2（T25）烧瓶中>细胞），使其在第二天达到50-80％融合。
  注意：COS-7细胞的加倍时间为〜18 h。
2. 准备转染复合物。
  注意：仅包含没有gDNA插入物的pSPL3载体的对照转染，另外没有质粒（仅限QIAGEN缓冲液EB）。
  1. 允许FuGENE 6和OptiMEM培养基平衡至室温
  2. 加入1.5ml Eppendorf管中
3. 使用无菌塑料转移移液管，将所有500μl转染混合物加入到T25瓶细胞的中心，每次滴加，轻轻旋转。
4. 在37℃下用5％CO 2孵育细胞24小时。
总RNA分离
接下来，使用RNeasy Mini Kit按照QIAGEN的说明书从COS-7细胞中分离总RNA：
注意：含有100％汇合（〜2.5×10 6细胞）的COS-7细胞的T25细胞培养瓶应产生约80μgRNA。执行所有步骤，包括在室温（21°C）下离心。向每1ml缓冲液RLT中加入10μl2-巯基乙醇（2-ME）
1. 吸出T25烧瓶培养基，并在5ml PBS中洗涤细胞;吸出所有PBS。
2. 加入3ml胰蛋白酶-EDTA，旋转以涂覆细胞并快速吸出溶液
3. 在37℃下孵育细胞，直到它们开始从烧瓶中分离（〜5分钟）
4. 加入含有10％FBS的5ml培养基灭活胰蛋白酶
5. 在培养瓶内上下移动培养基以重新悬浮细胞并将混合物转移到50ml Falcon管中。
6. 通过在300×g离心5分钟来造粒细胞;吸出上清液。
7. 加入350μl缓冲液RLT（含2-ME），移液管将混合溶液直接加入置于2 ml收集管中的QIAshredder旋转柱。
8. 在台式离心机中以最大速度离心2分钟。
9. 向匀浆的裂解液中加入350μl70％乙醇;通过移液混匀。此时不要离心。
10. 将700μl样品（包括任何沉淀物）转移到置于2 ml收集管中的RNeasy旋转柱上。
11. 以9,000 x g离心15秒;丢弃流通。
12. 将700μl缓冲液RW1加入色谱柱。
13. 以9,000×g离心15秒以洗涤柱膜;丢弃流通。
14. 向柱中加入500μl缓冲液RPE（含乙醇）
15. 以9,000 x g离心15秒以洗涤膜;丢弃流通。
16. 添加另外500μl缓冲液RPE到列。
17. 以9,000 x g离心2分钟以洗涤膜。
18. 将柱转移到新的2ml收集管中，并以最大速度离心1分钟以除去任何残留的乙醇
19. 将色谱柱放入新的1.5 ml收集管中。
20. 将50μl无RNase的水直接加入膜中。
21. 离心1分钟，以9,000×g/g的速度洗脱RNA样品。
22. 再加入30μl无RNase的水直接加到膜上
23. 以9,000 x g离心1分钟以洗脱剩余的RNA
24. NanoDrop RNA样品以量化产量（预期〜70μl总RNA，400-700 ng /μl）。
25. 将剩余的RNA储存在-80°C。
cDNA生成
接下来，使用高容量cDNA逆转录试剂盒与随机引物将RNA逆转录成cDNA。为了使反应最大化，RNA样品应首先用无RNase的水稀释至200 ng /μl。然后按照Applied Biosystems的说明书，进行逆转录反应以将2μg总RNA转化成20μl体积的cDNA。
1. 在冰上，对于每个样品，制备10μl的2x RT Master混合物：
2. 在冰上，轻轻混合组件。
3. 将10μl的2×RT Master混合物吸入冰冷的0.2ml PCR管中
4. 加入10μlRNA（200 ng /μl），轻轻摇动混匀
5. 将反应保持在冰上，直到加载到PCR热循环仪中，程序如下：
6. 将得到的cDNA产物储存在-20°C
pSPL3衍生转录物的RT-PCR分析
接下来，使用对应于载体外显子V1和V2中的序列的引物对，通过PCR特异性扩增剪接载体转录的cDNA种类（图1A和1B）。通过凝胶电泳显示来自野生型和突变型小基因的所得RT-PCR产物，并通过Sanger测序确定其序列组成（图1C）。
注意：PCR扩增前不需要除去cDNA样品的RNA组分。在40μlPCR反应中使用4μlcDNA样品作为模板。超过4μl（PCR反应体积的10％）不能使用，因为缓冲盐的携带可以抑制反应。
1. 在0.2ml PCR管中，如下设置40μlPCR反应：
  
  注意：包括阴性对照样品（加入4μl水而不是cDNA），以测试反应污染。
2. 使用以下循环条件进行PCR扩增：
3. 通过在1％琼脂糖凝胶上电泳分析PCR扩增产物（图1C）注意：没有gDNA插入的pSPL3载体将产生来自载体外显子V1和V2的257bp的单个RT-PCR产物（图1C）。包含TEK外显子5和6将产生530bp的单个RT-PCR产物（图1C）。包含TEK外显子22将产生357 bp的单一RT-PCR产物（图1C）。从突变外显子5和外显子22剪接位点构建体分别观察到551bp和357bp的单条带（图1C）。
4. 如果存在单个不同的条带，则应使用引物V1-F和V2-R（图1C）将样品送至直接的Sanger测序。如果存在多个条带，则在Sanger测序之前，每个条带应单独凝胶提取（QIAquick Gel Extraction Kit）。
  注意：从突变体TEK外显子5构建体中，Sanger测序确定了由包含21bp内含子5而导致的额外的转录物含量（图1C）。从突变体TEK外显子22构建体中，Sanger测序显示转录本中缺少任何TEK含量，仅含有来自载体外显子V1和V2的内容，表明外显子22在RNA剪接期间完全跳过（图1C）。 br />

数据分析

Sequencher软件（Gene Codes Corporation）可用于分析Sanger测序色谱图文件，以确定微型基因转录本的DNA序列组成。

笔记

Invitrogen网站提供了一个未经确认的6,031 bp pSPL3载体序列，从已知的用于构建它的片段序列组装： http://tools.thermofisher.com/content/sfs/vectors/pspl3_seq.htm 。
我们重新排序了我们内部的pSPL3向量（在补充文件1 ），并且与Invitrogen提供的序列相比，发现3bp缺失。我们的序列缺失的3个碱基在载体外显子1中为2bp，载体外显子2中为1b（显示在方括号内）。这些序列差异不在外显子内含子结上，如我们的实验数据所示，不影响剪接机制。
在我们的6,028 bp pSPL3序列（补充文件1 ），两个载体外显子以粗体和斜体显示，V1-F和V2-R引物被下划线。 Xho I（CTCGAG）和Bam HI（GGATCC）的多重克隆位点（MCS）识别序列也以粗体显示，并加下划线。

食谱

2 mM dNTPs

在室温下从dNTP Set中解冻4个单独的100 mM dNTPs
向1.5 ml螺旋盖管中加入460μldH 2 O
加入10μl每个dNTP
涡旋混合储存于-20°C

1x TAE（Tris，乙酸盐，EDTA）缓冲液
40mM Tris-HCl（pH7.8）
5mM乙酸钠
1 mM EDTA
1％或1.5％琼脂糖凝胶

将1％或1.5％（w/v）琼脂糖加入到500ml Pyrex瓶/瓶中的1×TAE缓冲液中。
在微波炉中加热，经常旋转瓶子，直到所有琼脂糖溶解到溶液中
通过将自来水流过瓶子一侧，轻轻旋转，将琼脂糖溶液冷却"手热"
每100ml凝胶溶液加入10μlSYBR安全DNA凝胶染色液，旋转混匀
立即将溶液倒入电泳托盘，并允许在室温下放置

10倍凝胶加载染料

向50ml Pyrex瓶中加入
2.5克Ficoll-400（25％最终浓度）
1ml 1M Tris-HCl（pH 7.8,100mM最终浓度）
2ml 0.5M EDTA，pH8.0（0.1M最终浓度）
用无核酸酶的水补足至10毫升
用一个磁力搅拌棒将溶液加热至65°C，以溶解Ficoll
加入溴酚蓝和橙G染料约15mg（如果优选更强的染料强度，则加上25mg）
混合好以溶解染料
在室温下存放

羧苄青霉素抗生素，1,000倍

向10ml Falcon管中加入10ml dH 2 O
加入1μg羧苄青霉素二钠盐
漩涡直到盐完全溶解了
通过使用注射器
将其通过0.2μm量规过滤器来消毒溶液
保持100毫克/毫升储备溶液冷冻1毫升等份在-20°C

LB（Luria-Bertani）培养基与羧苄西林抗生素

在1L耐高压灭菌瓶中，加入20g LB肉汤（Lennox）粉末微生物生长培养基至1L dH 2 O O
在121℃高压灭菌15分钟以消毒
允许冷却至室温，然后加入1μl/ml羧苄青霉素抗生素

LB琼脂与羧苄青霉素抗生素板

按照LB培养基的配方，但在高压灭菌前加入15 g选择Agar
在加入1μl/ml羧苄青霉素抗生素之前，让内容物冷却至"手热"
将每个板块倒入25毫升（本生灯火焰爆发的气泡）
允许在室温下固化
袋放置在堆叠中倒置并存放在4℃直到需要

致谢

该协议被用于以前在"临床调查杂志"（Souma等人，2016）发表的工作。我们感谢肖恩·马丁仔细阅读手稿和有用的意见。本研究由NIH R01 EY014685，"防止盲人研究"Lew R. Wasserman奖和威斯康星大学百周年纪念奖授予Terri L. Young的资助。作者宣称没有利益冲突。

参考

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Duyk，GM，Kim，SW，Myers，RM和Cox，DR（1990）。< a class ="ke-insertfile"href ="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2247475 "target ="_ blank">外显子捕获：用于鉴定克隆的哺乳动物基因组DNA中的候选转录序列的遗传筛选。Proc Natl Acad Sci USA 87（22）：8995-8999。 br />
Nisson，PE，Ally，A.，Watkins，PC（1994）。用于捕获内部和3'末端外显子的方案。 PCR方法应用4（1）：S24-39。
Souma，T.，Tompson，SW，Thomson，BR，Siggs，OM，Kizhatil，K.，Yamaguchi，S.，Feng，L.，Limviphuvadh，V.，Whisenhunt，KN，Maurer-Stroh，S.，Yanovitch， TL，Kalaydjieva，L.，Azmanov，DN，Finzi，S.，Mauri，L.，Javadiyan，S.，Souzeau，E.，Zhou，T.，Hewitt，AW，Kloss，B.，Burdon，KP，Mackey ，DA，Allen，KF，Ruddle，JB，Lim，SH，Rozen，S.，Tran-Viet，KN，Liu，X.，John，S.，Wiggs，JL，Pasutto，F.，Craig，JE，Jin ，J.，Quaggin，SE and Young，TL（2016）。