材料和试剂

Fisherbrand Superfrost Plus显微镜载玻片（Fisher Scientific，目录号：12-550-15）
一次性模具
盖玻片
C57BL/6小鼠
Tissue-Tek OCT化合物（SAKURA FINETEK，目录号：4583）
甲醛，37-40％ACS（新来者供应，目录号：1089）
Triton X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）（Thermo Fisher Scientific，Gibco ^{TM，目录号：10010023）}
来自二抗的宿主的血清
一抗：兔抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（Abcam，目录号：ab5694）
二次试剂：德克萨斯红色缀合山羊抗兔IgG抗体（Abcam，目录号：ab6719）
Prolong ^®金抗褪色试剂（Cell Signaling Technology，目录号：9071）或用DAPI（Cell Signaling Technology，目录号：8961）
石蜡
乙醇（Newcomer Supply，目录号：10841）
二甲苯（Newcomer Supply，目录号：1446）
S安装介质（Newcomer Supply，目录号：6750）
Bouin Fluid（Newcomer Supply，目录号：1020）
Biebrich猩红酸品红溶液（Sigma-Aldrich，目录号：HT151）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A3912）
胎牛血清（FBS）（GE Healthcare，Hyclone ^{TM，目录号：SH30396.03）}
曙红Y（Sigma-Aldrich，目录号：E4009）
乙酸，冰川（Sigma-Aldrich，目录号：A6283）
硫酸铝钾（Sigma-Aldrich，目录号：237086）
苏木精（Sigma-Aldrich，目录号：H3136）
碘酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：S4007）
柠檬酸（Sigma-Aldrich，目录号：251275）
氯化铁（Sigma-Aldrich，目录号：157740）
盐酸（Sigma-Aldrich，目录号：320331）
磷钼酸溶液（Sigma-Aldrich，目录号：HT153）
磷钨酸溶液（Sigma-Aldrich，目录号：HT152）
苯胺蓝（Sigma-Aldrich，目录号：415049）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4）（Sigma-Aldrich，目录号：S8282）
阻塞缓冲区（见配方）
曙红Y溶液（见配方）
曙红Y工作液（0.25％）（见配方）
Mayer的苏木精溶液（参见食谱）
Weigert的铁苏木精溶液（参见食谱）
磷钼铁磷酸溶液（见配方）
苯胺蓝溶液（参见食谱）

设备

冷冻切片机
-70°C冷冻箱
荧光显微镜或共聚焦显微镜
染色罐和滑架，例如EasyDip幻灯片染色系统（Newcomer Supply，目录号：5300KIT）
光学显微镜

程序

肺冷冻切片的免疫荧光染色冷冻的肺组织是通过气管充气具有最佳切割温度（OCT）化合物的肺来制备的，将气管夹紧以保持肺中的流体，并在含有OCT的一次性模具中冷冻组织。冷冻切片应在低温恒温切片机中切成5-10微米，安装在Superfrost Plus显微镜载玻片上并储存在-70℃的冷冻箱中。关于制备冷冻肺组织和切片的详细方案，请参阅Ling等人，2009年。
1. 从冰箱中取出冷冻切片后，立即加入50μl4％甲醛的PBS溶液以覆盖各部分
2. 在室温下将组织固定15分钟。
3. 用PBS封闭肺切片5分钟，然后滴入PBS。重复3次。
4. 通过在PBS中用0.1％Triton X-100覆盖切片10分钟（如果细胞内蛋白质染色），可以渗透细胞。
5. 在PBS中冲洗3次，每次5分钟。
6. 在PBS pH 7.5中从二次抗体宿主的5％血清的封闭缓冲液中孵育30分钟，以阻断抗体的非特异性结合。替代阻断缓冲液是PBS中的1％BSA或1％FBS。
7. 当阻断时，在封闭缓冲液中适当稀释制备一抗。例如，使用1：200稀释用于兔抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体（Abcam）。
8. 在室温下（或4℃过夜），用稀释的一抗孵育肺切片60分钟。
9. 在PBS中漂洗3次，每次15分钟。
10. 在室温下用封闭缓冲液稀释60分钟的荧光染料缀合的二次抗体孵育样品。例如，对于德克萨斯红缀合的山羊抗兔IgG抗体（Abcam）使用1：1,000稀释。从这一步向前，标本应避光
11. 在PBS中漂洗三次，每次15分钟。
12. 带有或不带DAPI的Prolong®镀金抗褪色试剂（图1）。 DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚）是一种蓝色荧光DNA染色剂，可作为固定细胞的理想核复染料。 DAPI染色不需要额外的步骤。
  
  图1.使用Prolong ^®金防褪色试剂在玻片上安装盖玻片。 A.安装盖玻片之前。 B.安装盖玻片后。
13. 允许介质在室温下固化过夜。
14. 通过将免疫荧光染色载玻片安装在荧光显微镜或共聚焦显微镜的平台上，观察（如有必要）进行照相（并进行照相）。
肺切片的H& E染色如Baligar等人所述，将肺固定并包埋在石蜡中。（2016）。肺切片应从石蜡包埋的肺组织切成4-5μm，并安装在载玻片上。
1. 将玻片放在玻璃染色架上。溶液装满方形玻璃染色瓶。对于EasyDip幻灯片染色系统，每个容器在染色架上容纳80ml试剂和12个载玻片。
2. 通过两个连续的二甲苯浴将馏分脱蜡，每次10分钟。
3. 通过不断浓缩的酒精水浴使肺部水分流失：2次绝对酒精，5分钟，95％酒精2分钟，70％酒精2分钟。
4. 在蒸馏水中短暂洗涤。
5. 在Mayer的苏木精溶液中染色8分钟
6. 在温暖的自来水中洗涤10分钟。
7. 用蒸馏水冲洗。
8. 在1％曙红Y溶液中复染30秒至1分钟
9. 在95％酒精和无水酒精中脱水，2次每次2分钟或直到除去过量的曙红。在显微镜下检查
10. 二甲苯清除2次，每次5分钟。
11. 带树脂安装介质的盖板滑块。
12. 通过将H& E染色的载玻片安装在光学显微镜的平台上，观察（如有必要）进行照相（如有需要）。
Masson的三段染色肺切片
1. 如上所述对肺部进行脱蜡和再水合。
2. 用蒸馏水清洗肺部。
3. 媒染剂在预热的Bouin流体中在56-60℃下持续1小时，或在室温下过夜
4. 在Weigert的铁苏木精溶液中染色10分钟
5. 在运行温水自来水中洗涤10分钟。
6. 用蒸馏水冲洗。
7. 在Biebrich猩红酸品红色溶液中染色10-15分钟。
8. 用蒸馏水冲洗。
9. 在磷钼磷钨酸溶液中分解10至15分钟。用肉眼观察幻灯片。一旦胶原蛋白丰富的区域失去红色，转而清除，进入下一步。
10. 将载玻片直接转移至苯胺蓝溶液并染色5至10分钟。用蒸馏水冲洗，并在1％乙酸溶液中分化2〜5分钟
11. 用蒸馏水冲洗。
12. 通过95％酒精脱水，然后用绝对酒精擦去Biebrich猩红酸品红染色。二甲苯清除。
13. 搭载树脂固定介质。
14. 通过将三色染色的载玻片安装在光学显微镜的平台上，观察（如有必要）（如有必要）拍摄。

数据分析

肺切片和染色是研究肺发育或肺部病理学的重要手段。免疫荧光染色显示感兴趣的蛋白质的表达和定位。 H& E染色最广泛地用于组织学研究和医学诊断。 Masson的三色染色检测组织中的胶原沉积。图2显示了已经经历骨髓移植的小鼠的肺切片上的每个染色的代表性图像，然后用鼠疱疹病毒68感染三周。

图2.肺部染色从经历了同基因EGFP表达骨髓移植5周的C57BL/6小鼠中取出肺，然后感染鼠疱疹病毒68（5× 10小时/小时）3周。由于免疫细胞的浸润和胶原蛋白的沉积，肺部发生了肺炎和肺纤维化。 A.肺部是用兔抗α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）抗体进行免疫荧光染色，α-SMA阳性细胞通过德克萨斯红缀合的山羊抗兔IgG抗体以红色显现。供体骨髓来源的细胞以绿色表达EGFP。 DAPI将所有细胞核重新染色为蓝色。 B.H& E染色染色细胞质粉红色和核蓝色; C. Masson的三色染色将胶原蛋白蓝色，细胞质粉红色和细胞核深棕色至黑色。

食谱

阻塞缓冲区
来自第二抗体宿主的5％血清或PBS pH7.5中的1％牛血清白蛋白（BSA）或胎牛血清（FBS）
Eosin Y解决方案
Eosin Y库存解决方案（1％）：
10 g伊红Y
200毫升蒸馏水
800 ml的95％乙醇混合溶解并在室温下储存
曙光Y工作液（0.25％）
250毫升伊红Y储备溶液
750毫升80％乙醇 5 ml冰醋酸（浓缩）
混合好并在室温下储存
Mayer的苏木精溶液
50克硫酸铝钾（明矾）
1克苏木精
0.2克碘酸钠
1克柠檬酸
1000毫升蒸馏水
搅拌以上述顺序溶解化学品
Weigert的铁苏木精溶液
库存解决方案A：
1克苏木精
100毫升95％酒精
库存解决方案B：
4毫升29％的氯化铁在蒸馏水中 95 ml蒸馏水
1ml盐酸，浓缩， Weigert的铁苏木精工作液：
混合相当部分的储备溶液A和B。该工作溶液稳定3个月
磷钼铁磷酸溶液
25毫升5％磷钼酸
25毫升5％磷钨酸
苯胺蓝溶液
2.5 g苯胺蓝色
2毫升醋酸，冰川
100ml蒸馏水

致谢

该协议是从我们的出版物（Zhou等人，2016）改编而成。这项工作得到NIH授权AI117229，HL115618，T32HL07749和2UL1TR000433的支持。

参考

Baligar，P.，Pokhrel，S。和Mukhopadhyay，A.（2016）。 CD45 ⁺骨髓细胞的实验性肝纤维化和脾内移植。 6（20）：e1972。 >
Ling，LH，Rogers，SM，Tay，V.，Limmon，GV，Dahai，Z.and Rogers，K。（2009）。用于冷冻小鼠组织冷冻切片的各种组织制备技术的比较 His Histechnol 32 （4）：186-189。
Zhou，X.，Loomis-King，H.，Gurczynski，SJ，Wilke，CA，Konopka，KE，Ptaschinski，C.，Coomes，SM，Iwakura，Y.，van Dyk，LF，Lukacs，NW和Moore，BB （2016）。骨髓移植改变肺抗原呈递细胞促进TH17反应，以及伽pes病毒感染后肺炎和纤维化的发展。粘膜免疫学9（3）：610-620。